RACK1在苯环利定致精神分裂症模型小鼠脑中的分布特点#

钟妍 王劲松 鲁英鹏 蒋礼蓉 黄薪屿 万莉红

（1.四川大学华西基础医学与法医学院2016级法医学，四川 成都 610041；2.四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室，四川 成都 610041）

精神分裂症是临床常见的严重的精神疾病，以定向力障碍、推理及问题解决、思维处理速度异常、学习与记忆能力下降等多种认知功能障碍为主要表现[1]。近年研究发现，以小胶质细胞为代表的免疫细胞功能异常与精神分裂症发生、发展密切相关[2]。

临床研究表明，精神分裂症患者中枢神经系统中小胶质细胞明显活化，不仅具有分泌促炎细胞因子的作用，还可激活下游的谷氨酸或者氧化应激途径[3]。尤其在精神分裂症急性期，小胶质细胞M1极化所释放的促炎因子IL-6、TNF-α明显升高[4]；而具有抑制炎症作用的M2极化所释放的IL-10则分泌不足[5]。可见，探寻小胶质细胞活化的调控因素将有利于深入研究精神分裂症的发病机制。

活化的C激酶1受体（Receptor of activated C-kinase 1，RACK1）是位于核糖体的支架蛋白，也是NF-κB信号通路中重要的负调控因子[6]，对TNF-α等因子的转录具有一定的调节作用[7]。然而RACK1是否参与精神分裂症的疾病过程尚无报道。本文拟通过建立小鼠精神分裂症模型，观察RACK1在脑内的分布特点，初步评价RACK1与精神分裂症的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

苯环利定购自上海凯试科技有限公司，50 mg/瓶，批号P295500；试验前用生理盐水配制成0.375 mg•ml-1苯环利定溶液。C57BL/6清洁级雄性小鼠，体重16-18 g，购自成都达硕动物有限公司，饲养于室温22-24℃、相对湿度50-60%、12 h昼夜循环交替照明环境中，所有小鼠自由摄食饮水并保持笼舍清洁。适应性饲养1 w后进行试验。

1.2 方法

1.2.1 精神分裂症模型建立

将48只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和精神分裂症模型组（n=24），其中模型组小鼠皮下注射苯环利定（Phencyclidine，PCP）1.5 mg•kg-1连续7 d建立精神分裂症模型；对照组小鼠连续7 d皮下注射等体积生理盐水。

1.2.2 刻板行为实验

将小鼠分别置于40 cm×40 cm×30 cm的观察箱中，适应3 min后观察小鼠1 min内的行为状态。小鼠处于静止、睡眠状态记1分；小鼠处于静止，清醒状态记2分；正常的梳理和咀嚼行为记3分；在箱内活动、嗅、站立（正常的警觉行为）记4分；在箱内跑动（活动亢进）记5分；正常活动水平下在箱内重复的探索行为（较缓慢的方式）记6分；活动亢进的情况下在箱内重复的探索行为（较快速的方式）记7分；在同一个位置重复快速地摆头和/或前肢运动(活动受限制)记8分；出现跳跃、维持异常的姿势和运动障碍记9分。测定5次后取平均值作为该小鼠的刻板行为最后得分。

1.2.3 病理分析及免疫荧光染色

每组随机选取小鼠5只，处死后以4%多聚甲醛心脏灌注固定，取脑组织制作全脑石蜡切片进行HE染色以及免疫荧光染色。免疫荧光染色切片以抗IBA-1和RACK1一抗（1: 200）4℃过夜孵育，次日复温至室温后以PBS洗3次，5 min•次-1；加入Cy3标记的荧光二抗（1:1000），室温孵育2 h后清洗、封片，荧光显微镜下拍照观察。

1.3 统计学处理

所有数据采用统计学软件Prism 5.0进行统计处理，计量资料以均数±标准差（±SD）表示，采用t检验；P<0.05被认为有统计学差异。

2 结果

2.1 刻板行为评估

精神分裂症模型组在观察箱中出现明显的在箱内重复的探索行为、在同一个位置重复快速地摆头和/或前肢运动、跳跃等刻板行为。经5次重复测定后均分统计显示，与对照组相比，PCP模型小鼠的刻板行为评分明显高于对照组（P< 0.05），见图1。

图1 小鼠刻板行为评分（n=24）

2.2 脑组织病理学分析

HE染色结果显示，对照组小鼠脑组织内神经元结构完整、胞体清晰、排列整齐。精神分裂症模型组小鼠脑组织内神经元结构与对照组小鼠相比未见明显改变，但排列不规则；且小胶质细胞明显增生。

2.3 小鼠脑内RACK1免疫荧光表达情况

RACK1在小鼠海马组织、中脑杏仁核、前额叶皮层均有分布，但对照组小鼠RACK1表达量较低，呈现的绿色荧光较浅；而精神分裂症模型组小鼠海马组织绿色荧光强度（RACK1）明显增强，红色荧光强度（IBA-1）略为增强，但并未出现IBA-1与RACK1融合，见图2。

图2 小鼠海马RACK1免疫荧光表达（×400，n=24）

3 讨论

PCP属于精神活性物质，具有诱导动物认知和感觉异常、模拟精神分裂症多重行为的作用，是目前建立精神分裂症动物模型的首选药物[8]。本次研究发现PCP注射后，诱发小鼠出现快速摆头、跳跃等刻板行为，这些刻板行为正好反映精神分裂症的阳性症状。可见，0.375 mg·ml-1苯环利定连续皮下注射7 d可成功建立小鼠精神分裂症模型。

研究显示精神分裂症与脑胶质细胞功能水平关系密切，包括：少突胶质细胞丢失[9]，小胶质细胞活化[4-5]以及星形胶质细胞过度激活[10]。可见，精神分裂症是中枢多种类型细胞参与的复杂的严重脑部疾病。其中活化的小胶质细胞因具有高度异质性和可塑性，成为当今研究的一大热点。而RACK1作为中枢广泛存在的核糖体蛋白，目前研究发现具有调控细胞生长、调控免疫功能等多种作用。为探究精神分裂症小鼠脑内RACK1的分布情况，本次研究采用免疫荧光染色的方式，通过标记小胶质细胞标记物IBA-1与RACK1双染观察二者的共定位情况，结果发现精神分裂症小鼠海马区RACK1表达明显增强，但是与IBA-1并未见共定位，从目前表达RACK1的细胞形态观察来看，仍以神经元表达为主；而且神经元的排列明显出现不整齐的现象，说明RACK1与精神分裂症小胶质细胞活化的相关性不大；而主要与神经元功能水平相关。

因此RACK1的表达分布特点可能与精神分裂症的行为、认知功能障碍相关，深入研究揭示神经元RACK1在精神分裂症中的作用将会为精神分裂症的疾病诊治开创新的视野。