梨杷止咳合剂质量标准研究*

符 冰 ，刘锐锋△，赵伟国，王术玲，巫柳岑

（1. 广东省中山市人民医院，广东 中山 528403； 2. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006）

梨杷止咳合剂为中山市人民医院验方，由梨干、菊花、桑白皮、苦杏仁等8 味中药制成，有清热去燥、润肺生津等功效，临床用于治疗肺燥咳嗽、喉痒干咳、久咳不止等症。周俊等［1］对合剂中微生物限度进行了检查，并对桔梗、甘草、菊花进行薄层色谱（TLC）鉴别，但缺少含量测定项。本研究中拟对合剂中的桑白皮、苦杏仁、枇杷叶进行定性鉴别，并对菊花中木犀草苷及3，5-双咖啡酰基奎宁酸进行含量测定，为该合剂质量标准的建立提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；WFH-201BJ 型紫外可见投射反射仪（上海精科实业有限公司）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；硅胶薄层板（青岛海洋化工厂分厂）；BP211D 型电子天平（德国Sartorius 公司）；点样用毛细管（华西医科大学仪器厂）；MODEL HN1006 型超声清洗器（中国华南超声设备厂）；双槽层析缸（上海信谊仪器厂）。

1.2 试药

梨杷止咳合剂（批号分别为20181216，20190415，20190521），缺桑白皮、苦杏仁、菊花药材的阴性样品，均为广东省中山市人民医院制剂室自制；木犀草苷对照品（麦克林公司，批号为 c805135，含量≥98% ）；3，5-双咖啡酰基奎宁酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号为B21539，含量≥98%）；绿原酸对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号为17101904，含量≥98%）；枇杷叶（批号为 190203）、菊花（批号为 180901）、桑白皮（批号为 180901）、甘草（批号为 20180830）、北沙参（批号为 20180903）、苦杏仁（批号为 190201）、桔梗（批号为20180819）、梨干（批号为20190401）药材饮片均购自广州康圣药业有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

桑白皮：取样品50 mL，加Na2CO3使之成为过饱和溶液，超声（功率300 W，频率40 kHz，下同）处理20 min，离心，收集上清液，用稀盐酸调pH 至1 ～2，静置30 min，滤过，滤液用50 mL 乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，即得供试品溶液，平行制备3 份。称取桑白皮对照药材2 g，同法制备对照药材溶液。取缺桑白皮药材的阴性样品50 mL，同法制备阴性对照品溶液。取十二烷基磺酸钠3 g、正丁醇6 mL、正庚烷 2 mL，加水 25 mL，搅拌溶解，放置 24 h 即得 O ／W 微乳液［2］。照 2015 年版《中国药典（四部）》通则 0502“薄层色谱法”［3］项下方法，分别吸取上述 3 种溶液各 6 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以上述微乳液为展开剂，展开，取出，自然晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。

苦杏仁、枇杷叶：取样品10 mL，采用大孔树脂分离纯化，用3 倍柱体积的水及10%乙醇依次冲洗，弃去洗液；用80%乙醇清洗大孔树脂柱，洗脱液水浴蒸干，用 1 mL 甲醇溶解残渣，即得供试品溶液［4］，平行制备3 份。称取苦杏仁对照药材2 g，置索氏提取器中，加二氯甲烷50 mL，加热回流2 h，弃去二氯甲烷液，药渣挥干，加甲醇30 mL，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加入1 mL 甲醇溶解，即得苦杏仁对照药材溶液；取枇杷叶10 g，按苦杏仁对照药材溶液制备方法制得枇杷叶对照药材溶液。取缺苦杏仁、枇杷叶药材的阴性样品2 mL，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2015 年版《中国药典（四部）》通则0502“薄层色谱法”［3］项下方法，分别吸取上述 4 种溶液各4 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯 -甲醇 - 水（15 ∶40 ∶22 ∶10，V ／ V ／ V ／ V）的下层溶液为展开剂，展距约为10 cm，取出，立刻用0.8%磷钼酸的15%硫酸乙醇溶液浸板，加热到105 ℃至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置处显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex R Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -0.5%冰醋酸溶液（15 ∶85，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：350 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

称取木犀草苷、3，5-双咖啡酰基奎宁酸、绿原酸对照品适量，精密称定，置同一50 mL 容量瓶中，以70%甲醇定容，摇匀，配成木犀草苷质量浓度为80.07 μg／mL、3，5-双咖啡酰基奎宁酸质量浓度为 37.09 μg／mL、绿原酸质量浓度为 64.56 μg／mL 的混合对照品溶液。精密量取4 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇5 mL，超声处理 5 min，加甲醇定容，摇匀，取上清液 1 mL，经 0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按处方工艺取除菊花外的其他药材，依法制备阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性考察：精密吸取 2.2.2 项下 3 种溶液各 10μL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果木犀草苷峰保留时间为 25.7 min，3，5 -双咖啡酰基奎宁酸峰保留时间为39.5 min；木犀草苷分离度为 1.7，理论板数为21 000；3，5-双咖啡酰基奎宁酸分离度为 5.4，理论板数为16 710；基线分离良好，均能与杂质分开，阴性对照无干扰（绿原酸受阴性对照干扰较大，不作为检测指标）。色谱图见图2。

线性关系考察：精密吸取2.2.2 项下混合对照品溶液 1 mL，分别进样 1，2，5，10，15，20 μL。以待测成分峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得回归方程，木犀草苷为 Y1＝2 568 242.785 X1-19 971.392 79（R12＝0.999 8，n ＝6），3，5- 双咖啡酰基奎宁酸为 Y2＝ 1 716 451.385 X2-25 808.439 86（R22＝0.999 8，n ＝ 6）。结果，木犀草苷、3，5 - 双咖啡酰基奎宁酸进样量分别在 0.080 1 ～1.601 4 μg 和0.037 1 ～0.741 8 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2.2 项下混合对照品溶液，连续进样6 次，测定峰面积。结果木犀草苷及3，5-双咖啡酰基奎宁酸峰面积的 RSD 分别为1.12% 和1.01%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为20190415），依法制备供试品溶液，室温下分别于 0，2，5，8，12，24 h 时按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果木犀草苷、3，5-双咖啡酰基奎宁酸峰面积的 RSD 分别为1.87%和1.88%（n ＝6），表明供试品溶液室温下放置24 h 内基本稳定。

重复性试验：精密量取样品（批号为20190415）6 份，按 2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件进样测定，计算样品含量。结果木犀草苷、3，5-双咖啡酰基奎宁酸平均含量分别为 0.134 9，0.827 8 mg／mL，RSD 分别为 3.40%，3.00%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：木犀草苷，精密量取样品2 mL，共6 份，加入混合对照品溶液 3.2 mL；3，5-双咖啡酰基奎宁酸，精密量取样品2 mL，共6 份，加入混合对照品溶液4.5 mL。均按 2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按 2.2.1项下色谱条件进样分析，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n ＝6）Tab.1 Results of recovery tests（n ＝ 6）

2.2.4 样品含量测定

取 3 批（批号分别为 20181216，20190415，20190521）样品，按2.2.2 项下方法平行制备供试品溶液2 份，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，计算样品含量和平均值。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg／mL，n ＝2）Tab.2 Results of content determination of samples（mg ／mL，n ＝ 2）

3 讨论

3.1 检测条件选择

指标成分：梨杷止咳合剂组方中以梨干和菊花为君药，因梨干为药食同源药材，成分多以微量元素为主，因此选取菊花的有效成分作为本合剂的质量控制指标。2015 年版《中国药典（一部）》规定，菊花质量控制成分选用木犀草苷、3，5-双咖啡酰基奎宁酸和绿原酸，但合剂中桑白皮也含有绿原酸，考虑其受干扰较大，故选用木犀草苷和3，5-双咖啡酰基奎宁酸为高效液相色谱法进行含量测定的指标成分。此外，批号 20190415 样品与批号20181216，20190521 样品在制备工艺中所用菊花的产地不同，故木犀草苷、3，5-双咖啡酰基奎宁酸含量有差异。

薄层色谱（TLC）条件：桑白皮的TLC 条件参照2015年版《中国药典（一部）》，采用碱溶酸提法提取，考察不同展开系统，最终选择O／W 微乳液做展开剂，相比于传统TLC 的展开剂，O／W 微乳液作展开剂的TLC 图中斑点更清晰、数目更多，且低毒，还具有明显的荧光增强增敏效应［5］。梨杷止咳合剂中苦杏仁、枇杷叶均含有苦杏仁苷，本试验参照2015 年版《中国药典（一部）》，前处理采用二氯甲烷提取，经多次试验发现产生乳化现象，不利于继续试验，改用乙醚萃取可避免乳化［6］，但斑点不清晰，改用大孔树脂洗脱，提取更完全，斑点清晰，分离更好。

流动相：预试验中考察了乙腈 -0.05% 磷酸［7］，乙腈 -0.1% 磷酸［8］，乙腈 -0.5% 冰醋酸溶液［9］等体系，结果显示，乙腈-0.5%冰醋酸溶液等度洗脱对成分的灵敏度更高，木犀草苷、3，5-双咖啡酰基奎宁酸各个峰的分离度更好，峰形对称，重复性较好，拖尾因子较小。

检测波长：选择木犀草苷和3，5-双咖啡酰基奎宁酸含量的测定波长时考察了 350 nm［10］、327 nm［11］、284 nm、254 nm 4 个检测波长，结果发现，木犀草苷、3，5-双咖啡酰基奎宁酸在350 nm 波长处响应效果、分离度、重复性等均较好，因此确定350 nm 作为检测波长。

3.2 方法评价

药理研究表明，桑白皮水煎液有止咳效果［12］；苦杏仁苷对呼吸中枢有一定抑制作用，可使呼吸运动趋于安静，最终达到镇咳、平喘的作用［13-14］，且苦杏仁苷的药理作用与枇杷叶止咳祛痰功效相对应［15］；木犀草苷具有止咳、祛痰、平喘等功效［16］；3，5- 双咖啡酰基奎宁酸具有抗菌、消炎、止痛等功效［17］。因此，采用 TLC 法对梨杷止咳合剂中桑白皮、苦杏仁、枇杷叶进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定菊花中木犀草苷和3，5-双咖啡酰基奎宁酸的含量。该方法样品处理简单，易操作，重复使用率高，精确度高，为其质量控制提供了理论基础，同时也为梨杷止咳合剂的进一步开发提供参考。