耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制及其分子检测

李子尧，鲁炳怀

肺炎克雷伯菌是一种机会性病原体，可引起社区获得性感染和医院感染，约占所有革兰阴性感染的1/3，如尿路感染、膀胱炎、肺炎、外科伤口感染、心内膜炎和败血症，特别多见于免疫力低下的人群[1]。高毒力的肺炎克雷伯菌还会导致坏死性肺炎、化脓性肝脓肿和内源性眼内炎[2～4]。碳青霉烯类抗生素是广谱β-内酰胺类药物，可用于治疗各种肺炎克雷伯菌引起的感染，然而我国的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CR-KP)的分离率呈逐年上升状态，对CR-KP的耐药机制的研究是非常有必要的。

1 几种常见的CR-KP耐药机制

CR-KP对碳青霉烯类抗生素的耐药性是由不同耐药机制共同介导的，主要有碳青霉烯酶的生成、孔蛋白的改变和外排泵活性的增加等。

1.1碳青霉烯酶 在青霉素发现并纯化后不久，便鉴定出了β-内酰胺酶，其可以降解青霉素类抗生素而产生耐药[5]。β-内酰胺酶主要集中在细菌的周质内，从而在β-内酰胺类药物到达细胞壁中的青霉素结合蛋白(penicillin binding protein，PBP)靶位之前将其β-内酰胺环水解。目前对β-内酰胺酶有两种分类方法，第一种是按照其一级分子结构的分子分类法(Ambler分类系统)[6]，也是目前最常用的分类法；第二种是按照其结合水解和抑制功能特性的功能分类法(Bush-Jacoby分类系统)[7]。《临床微生物手册》给出了β-内酰胺酶分类，见表1，可供参考[8]。碳青霉烯酶是一种能水解碳青霉烯类抗生素(如厄他培南、亚胺培南与美罗培南)的β-内酰胺酶。通常情况下，碳青霉烯酶也可以水解β-内酰胺类抗生素，如青霉素类、β-内酰胺类-β内酰胺酶抑制剂复合制剂、头孢菌素类等。通常而言，产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌一般意味着对目前所有β-内酰胺类药物均耐药。产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。自从IMP-1自肺炎克雷伯菌鉴定出后，多种碳青霉烯酶陆续发现，如GES-4、VIM-1、NDM-1、OXA-48、KPC-2。其中KPC酶成为最重要的碳青霉烯酶，可由质粒介导快速传播。IMP对碳青霉烯类抗生素水解能力较弱，携带并不一定在药敏试验中对碳青霉烯类耐药。Ambler分类法将β-内酰胺酶分为A、B、C和D四大类β-内酰胺酶。碳青霉烯酶根据其分子结构的差异分为3类，分别隶属于Ambler分类系统中的A、B和D类β-内酰胺酶，由bla基因编码。A类和D类碳青霉烯酶需要丝氨酸作为他们的活化位点，而B类金属-β-内酰胺酶(metallo-β-lactamases,MBLs)需要金属锌作为其活化中心。Ambler A类β-内酰胺酶是最大的一类β-内酰胺酶，其特点是活性部位含有丝氨酸。它能够灭活大部分的β-内酰胺类药物。该类β-内酰胺酶包括青霉素酶、头孢菌素酶、窄谱和广谱β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases，ESBLs)和碳青霉烯酶。它们对克拉维酸和他唑巴坦的抑制作用的敏感性是可变的，但都可被新型β-内酰胺酶抑制剂包括阿维巴坦、瑞来巴坦(relebactam)和维博巴坦(vaborbactam)所抑制[7,9]。在CR-KP中经常观察到的各种重要的β-内酰胺酶[例如ESBLs(TEM、SHV、CTX-M)和KPC]都属于这类β-内酰胺酶。TEM型β-内酰胺酶能够水解早期头孢菌素和青霉素，在肺炎克雷伯菌中比较常见。SHV-1具有与TEM-1相似的底物和抑制谱，几乎普遍存在于肺炎克雷伯菌中[10]。因为抗生素的选择压力及耐药基因在各个细菌之间进行转移，TEM和SHV酶的基因均已发生相当多的突变，这导致这两种酶类型的高度多样性，也增加抗生素的耐药范围[7,10]。目前已有报道SHV-1和SHV-11的大量产生降低了哌拉西林-他唑巴坦的有效性[11]。包括CTX-M在内的其他A类ESBLs(PER酶、GES酶和VEB酶等)目前已在包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、肠杆菌在内的肠杆菌病原体中得到鉴定[12,13]。大多数A类ESBLs仍然对克拉维酸敏感。但仍然有部分A类ESBLs(如TEM-30、SHV-10和TEM-50)表现出对各种β-内酰胺酶抑制剂的敏感度降低[14]。产碳青霉烯酶(如KPC酶)的肺炎克雷伯菌早有报道，而且是引起CR-KP的重要原因，如KPC-1可导致对亚胺培南、美罗培南、阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶、氨曲南和头孢曲松的耐药[15]。KPC酶的编码基因通常位于转座子Tn4401内，允许其在其他革兰阴性菌中传播[16]。虽然在含有KPC丝氨酸碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌中发现β-内酰胺酶抑制剂的抑制物，但产KPC酶的感染仍然可以成功地用各种新的β-内酰胺-β-内酰胺酶抑制剂组合所治疗，包括亚胺培南-瑞来巴坦、美罗培南-维博巴坦和头孢他啶-阿维巴坦[17]。但不幸的是，目前已有关于产KPC酶的肺炎克雷伯菌对头孢他啶-阿维巴坦耐药的报道[18,19]。Ambler B类β-内酰胺酶代表了另一组临床上重要的酶。因其活性位点上需要锌离子，故而也称为MBLs。MBLs能水解大多数β-内酰胺，包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和β-内酰胺酶抑制剂，但氨曲南除外，其可被乙二胺四乙酸EDTA抑制[7,20,21]。由于重要的MBLs(如IMP、VIM和NDM家族的MBLs)都可被整合到可移动基因元件中，而伴随着这些可移动基因元件在细菌之间的转移，碳青霉烯酶的氨基酸发生取代，产生碳青霉烯酶的不同变体。这导致碳青霉烯酶的活性及其对碳青霉烯类抗生素的亲和力发生变化，所以对MBLs需要引起特别的关注[22,23]。Ambler D类β-内酰胺酶主要由苯唑西林水解酶(oxacillin hydrolase，OXA)组成，能水解具有ESBLs样底物特性的苯唑西林及其衍生物，几乎所有OXA酶，除了OXA-18，都对β-内酰胺酶抑制剂耐药[7,24]。肺炎克雷伯菌可通过携带有OXA-48基因的质粒来表达获得OXA-48[25]。同时这些质粒中也编码了其他ESBLs，如CTX-M，从而使肺炎克雷伯菌对大多数β-内酰胺类抗生素耐药[26]。

表1 β-内酰胺酶分类

1.2孔蛋白 外膜蛋白通道(孔蛋白)的数量及功能的改变也是碳青霉烯类耐药的重要机制。CR-KP中经常观察到主要外膜蛋白OmpK36和OmpK35的改变[27]。这些改变可能在治疗过程中出现，增强了其他抵抗机制的影响，如降解酶。在治疗莫西沙星敏感的肺炎克雷伯菌感染时，发生了OmpK36的缺失及Amp C β-内酰胺酶的表达[28]。也有报道[29,30]称肺炎克雷伯菌孔蛋白突变确实降低了肺炎克雷伯菌对碳青霉烯的敏感性，但不赋予其临床耐药性，需要β-内酰胺酶。荚膜的生成似乎也和孔蛋白的生成有着一些联系。KvrA是一种控制荚膜产生的转录抑制因子。目前已有报道证明KvrA的缺失降低了OmpK35和OmpK36孔蛋白的产生，从而降低了产KPC-3的肺炎克雷伯菌对美罗培南-维博巴坦的敏感性[31]。

1.3外排泵 外排泵能够主动将药物挤出细胞，其编码基因可以位于染色体上或可移动基因元件内。已经被鉴定的外排泵有6个主要家族：RND家族、MFS家族、MATE家族、SMR家族、ABC家族和PACE家族[32～34]。大多数外排泵是多药转运体，能有效地泵出多种抗生素，从而导致多药耐药性。其中RND家族外排泵在革兰阴性菌中是特别值得关注的。这种类型的外排泵可以排出各种抗生素和结构上不相关的分子。AcrAB-TolC是典型的属于RND超家族的多药外排泵，通常是染色体编码的，但也可以通过质粒获得。在肺炎克雷伯菌中AcrAB-TolC的过量生产是多重耐药的重要特点，当其缺失时，多种药物的耐药性也降低数倍[35,36]。而且在含有碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌中，AcrAB突变表达与β-内酰胺酶活性会产生协同效应，导致高水平的碳青霉烯类耐药性[37]。

2 常用的分子生物学检测技术

目前，临床上检测CR-KP的方法仍然是以培养作为鉴定的金标准，但由于培养所需的时间较长，会导致临床错过最佳的治疗时间，降低了临床患者的生存率。分子生物学检测方法由于其灵敏、快速的特点可大大弥补培养导致的延误。以下简要介绍几种分子生物学检测CR-KP的技术。

2.1聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)类技术 目前应用于检测的常用PCR的方法主要有普通PCR、实时定量PCR及多重PCR，可用于检测KPCs、NDMs、IMPs、VIMs与OXA-48等碳青酶烯类耐药基因。普通PCR及实时定量PCR无论是临床还是其他地方，早已被广泛接受。而多重PCR，相比于普通PCR及实时定量PCR，其能够同时检测多个基因的特点，曾引起广泛关注，但其受到引物及靶标设计等诸多因素影响，限制了其发展[38～41]。赛沛公司的GeneXpert分子诊断系统推出的Xpert Carba-R检测试验盒与生物梅立埃公司的FilmArray的多重PCR分子诊断系统，可在大约1 h内直接从标本或纯菌落中定性检测和区分常见碳青霉烯酶基因(如blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48和blaIMP)，其灵敏度和特异度均较高[42～44]。PCR类技术最大的优点是快速、灵敏，但缺陷也相当明显，只能用来检测有限的已知的基因，不能发现新的相关基因。

2.2基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)检测技术 MALDI-TOF MS的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使生物分子电离，然后在电场作用下飞过飞行管道，检测到达检测器的飞行时间来测定离子的质荷比(M/Z)。目前，已广泛应用于微生物的鉴定。MALDI-TOF MS检测耐药主要通过检测细菌产生的酶，灭活抗生素产生的物质或者耐药细菌特有的物质等[45]。相比于改良的Hodge实验、脉冲场凝胶电泳等技术，其用时大幅度缩短，灵敏度及特异度均较高[45,46]。但其缺陷是目前还不能够准确地报告最低抑菌浓度[47]。MALDI-TOF MS目前已在各个实验室得到应用，未来使用MALDI-TOF MS来检测CR-KP的方法可能会应用于临床。

2.3测序技术 目前应用最广泛的就是全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)。基因组包含了细菌的全部遗传信息，进行WGS可以明确细菌的具体耐药基因，预测细菌的耐药情况，发掘潜在未知的耐药机制[48]。但是WGS的缺陷也非常明显，其成本高，用时长等。所以目前尚未应用于临床的检测，仅用于科研工作。近年来Nanopore测序技术用于耐药菌的检测，因其灵敏度高、用时短、成本低等优点，Nanopore技术也引起了关注[49]。

2.4环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术 LAMP技术是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在DNA聚合酶的作用下，60～65 ℃恒温扩增，1 h左右即可完成核酸扩增，效率可达109～10个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等优点[50]。检测可以在水浴或加热块中进行[51]。相比于PCR，LAMP检测产KPC酶的肺炎克雷伯菌的灵敏度、特异度更高而且更快[52]。但目前LAMP技术远没有PCR技术成熟，这可能是限制其应用于临床的重要因素之一。

3 小结

碳青霉烯类抗生素一直是治疗肠杆菌属(如肺炎克雷伯菌)引起的严重感染的最主要的药物。但近年来，碳青霉烯类抗生素的滥用造成了选择压力，导致耐药基因突变或传播。肺炎克雷伯菌通过β-内酰胺酶、孔蛋白的改变和外排泵活性的增加获得高水平的耐药性。这强调了在治疗过程中需要正确使用碳青霉烯类抗生素。本文仅简要对肺炎克雷伯菌的碳青霉烯类抗生素的耐药机制进行了总结。其中一部分耐药基因可以编码到可移动遗传元件上，而这些移动元件上同时又编码了其他的毒力及耐药基因，这就导致高毒力高耐药的肺炎克雷伯菌的出现[53,54]。但目前对于CR-KP的诊断还仍然以培养作为金标准，报告周期较长，不能及时指导临床合理正确地用药。虽然目前已经有多种分子生物学检测技术如PCR、MALDI-TOF MS、测序和LAMP等技术，但由于诸如设计、成本等多种原因，大部分目前尚未应用于临床，使得报告周期没有明显缩短。所以了解CR-KP的耐药机制，改进检测方法，便于临床尽早作出报告，有助于对其进行预防及控制，防止其进一步进化。