侵袭性肺部真菌感染的实验室检测方法

郭鹏豪，廖 康，伍众文，何宇婷，陈怡丽，刘 敏

侵袭性肺部真菌感染指不包括真菌寄生和过敏所致的支气管肺部真菌感染,分为原发性和继发性两种类型[1]。近年来，随着人口老龄化﹑器官移植免疫抑制剂的使用、肿瘤放化疗、造血干细胞移植、超广谱抗生素和多种抗生素联合应用、皮质类固醇激素的使用以及各种导管介入治疗等，使侵袭性肺部真菌感染的发病率呈现逐渐上升的趋势。由于肺部真菌感染临床表现常无特异性，早期诊断困难，且病情易被基础病掩盖，造成误诊、漏诊而延误治疗。正确、及时诊断肺部真菌感染依赖于实验室精准的检测结果。笔者现对肺部真菌感染常用的实验室检测方法，包括传统方法(直接镜检、真菌培养)、血清学检测[G试验、曲霉菌抗原、隐球菌荚膜多糖抗原(cryptococcal polysaccharide capsule antigen,CrAg)、曲霉菌抗体]和核酸检测等进行介绍。

1 侵袭性肺部真菌感染的流行情况

目前我国学者报道的侵袭性肺部真菌感染的病原体分布具有一定的差异。闫晓培等[2]报道在非移植患者中最常见的病原体是隐球菌、曲霉菌和毛霉菌。屈晶晶等[3]报道在非重症监护室确诊肺真菌病患者中的前4位病原体分别为曲霉菌、隐球菌、毛霉菌和组织胞浆菌。北京协和医院一项长达15年，针对187例的肺真菌病组织病理学的回顾性分析[4]结果显示：肺曲霉病85例(45.5%)，肺隐球菌病51例(27.3%)，肺毛霉病6例(3.2%)，肺组织胞浆菌病3例(1.6%)，肺念珠菌病3例(1.6%)，肺孢子菌病2例(1.1%)，不能明确分类37例(19.8%)。笔者所在单位中山大学附属第一医院从2019-01～2020-12临床诊断为侵袭性肺部真菌感染的患者198例，其中以曲霉菌为主，其次为新型隐球菌、马尔尼菲篮状菌等，具体分布见图1。其中马尔尼菲篮状菌的分离率高于国内目前的报道，这与该菌种的流行区域有关。

图1 2019-01～2020-12中山大学附属第一医院临床诊断侵袭性肺部真菌感染患者的病原体分布图

2 实验室检测方法

2.1直接显微镜检查 直接显微镜检查是一种快速、性价比高的方法。采集痰、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、肺组织等标本，通过显微镜观察标本中是否存在真菌孢子及菌丝，同时根据孢子及菌丝的特点对于菌种的种属进行初步判定。直接镜检结果也能指导实验室选择最适合真菌体外生长的培养条件。目前最常用的染色方法包括氢氧化钾(KOH)湿片、革兰染色、六胺银染色、钙荧光白染色等[5]。KOH湿片法通过对标本中的蛋白质成分进行消化，留下完整且更加明显的真菌细胞壁，从而将标本内的真菌与其他成分进行区分。六胺银染色通过将银离子沉积在胞壁上，把真菌染成黑色轮廓，背景呈淡绿色，较革兰染色更易识别且形态更加清晰，但操作相对比较复杂。钙荧光白染色通过荧光染料非特异地与真菌细胞壁中的几丁质结合，在荧光显微镜下真菌菌体呈浅蓝或绿色，具有较高的敏感性。荧光抗体染色则可针对不同真菌种属进行特异性染色，对标本进行消化、富集以后再进行相应的染色，可提高直接显微镜检查的灵敏度。对于有条件的实验室建议开展钙荧光白染色或者荧光抗体的染色方法，提高检测的灵敏度。另外需要注意的是，处理患者标本时应采取全面的防护措施，在生物安全柜内进行标本的操作。临床标本直接涂片染色时真菌的显微镜下形态见图2。

ⓐ曲霉菌丝(KOH湿片)；ⓑ曲霉菌丝(革兰染色)；ⓒ新型隐球菌(墨汁染色)；ⓓ曲霉菌丝(钙荧光白染色)；ⓔ毛霉菌丝(钙荧光白染色)；ⓕ马尔尼菲篮状菌孢子(钙荧光白染色)

2.2组织病理学检查 组织病理是诊断真菌感染的金标准，应与微生物学检查密切结合[5]。苏木素-伊红(HE)染色可用于筛查。如果HE染色后怀疑真菌，则可使用针对真菌特定结果的染色方法[碘酸-希夫(PAS)染色、GMS染色等]。PAS染色可使真菌染成鲜红色，GMS染色也可用于组织病理学检查，使真菌呈黑色。

2.3真菌培养 从呼吸道标本中培养分离到真菌是诊断侵袭性肺部真菌感染的重要依据之一。目前已发表文献[6～8]显示真菌培养的阳性率为56.0%～81.0%。对分离到的真菌可以通过如形态学、生化反应、质谱仪等技术进行准确的鉴定并进行药敏检测，从而为临床抗真菌药物的选择提供重要的依据。当怀疑有肺部真菌感染时，建议至少送检3个高质量的呼吸道标本进行培养。需要注意的是临床标本中真菌培养阳性并不一定代表侵袭性感染，区分呼吸道定植和侵袭性感染是相当困难的[9,10]。当标本真菌培养的结果为阳性时，需要结合其他的检测指标进行综合评估。在临床表现相符的情况下，从组织或者其他呼吸道标本中发现菌丝，且从同一标本中培养出大量的曲霉(或者从多个标本中检查出相同的菌种)预示侵袭性肺曲霉菌病。由于念珠菌可在口腔、呼吸道定植，有学者[11]认为呼吸道标本无论单次还是多次阳性，无论菌落数多少，对诊断均无意义。国内一些学者[12]则认为呼吸道标本合并真菌感染存在的危险因素时，在排除细菌感染的前提下，不能忽视多次下呼吸道分离出同一种念珠菌对诊断的价值。侵袭性肺部真菌感染常见病原体的菌落形态见图3。

ⓐ烟曲霉(沙氏平板，28 ℃培养3 d)；ⓑ新型隐球菌(沙氏平板，28 ℃培养5 d)；ⓒ马尔尼菲篮状菌(沙氏平板，28 ℃培养5 d)；ⓓ根霉菌(沙氏平板，28 ℃培养2 d)

2.4血清学检测

2.4.1 1，3-β-D葡聚糖检测(G试验) 1，3-β-D葡聚糖是真菌细胞壁的重要组成成分，除隐球菌属、接合菌以外的大部分真菌都可以通过G试验进行检测，该试验被欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组(European Organization for the Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group，EORTC/MSG)共识纳入为侵袭性真菌感染诊断的间接微生物学标准之一[13]。血清G试验被推荐为侵袭性真菌感染的筛选试验，但是阳性结果并不能明确是哪一种特定真菌的感染。该试验的阳性预测值和阴性预测值随着患者群体的不同而有差异。多次结果阳性或者检测结果远远超过阳性阈值时，阳性结果的置信度增加[14]；重复检测的阴性结果具有较好的阴性预测值。由于1，3-β-D-葡聚糖没有国际标准物质，不同厂家的试剂盒均需要使用自己的参考范围进行结果评价[5]。另外，如透析用纤维素膜、免疫球蛋白、白蛋白、手术患者大量纱布暴露等可引起G试验出现假阳性的结果[15]。

2.4.2 CrAg检测 CrAg检测是一种简单有效、创伤小、灵敏度和特异度较高的诊断肺隐球菌病的技术，在肺隐球菌病的早期诊断、病情监测和预后判断中起到重要作用。荚膜多糖在菌体生长和繁殖过程中不断分泌到胞外，可以作为隐球菌感染的诊断依据。世界卫生组织建议当CD4细胞<100个/μl时需监测血清CrAg[16]，若血清CrAg阳性时，需对抗原的滴度进行定量检测。抗原滴度的降低是隐球菌感染治疗有效的指标。然而，抗原滴度有可能在非艾滋病患者治疗的初期下降，但在隐球菌完全清除以后一直保持较高的滴度水平[17]。CrAg检测方法包括乳胶凝集法、酶联免疫法和免疫侧向层析法(lateral flow immunochromatographic assays，LFA)。目前美国IMMY公司的LFA可通过血清、血浆、脑脊液标本检测新型隐球菌和格特隐球菌，其检测灵敏度和特异度在血清标本中分别为98%和100%[18]。与乳胶凝集法和酶联免疫法相比，LFA的灵敏度更高，同时具有廉价、操作简单的优点。白吉利地霉(Geotrichum beigelii)可导致假阳性的结果，而假阴性结果可能由于抗原浓度低或者高浓度(前带效应)所引起。

2.4.3 曲霉菌抗原检测 曲霉菌抗原的检测成分是半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)。GM是曲霉细胞壁上主要的多糖成分，其可在菌丝生长的过程中被释放出来。该试验被EORTC/MSG纳入免疫抑制患者中侵袭性曲霉菌病的诊断标准。GM试验可采用血清、BALF、脑脊液标本，其诊断效能与基础人群、是否接受预防、诊断试剂等因素相关。血清GM在粒细胞缺乏的患者中其灵敏度显著高于非粒细胞缺乏的患者。血清GM单个样本阳性(GM结果≥0.7)或者两个样本≥0.5被认为有诊断价值[19]。虽然BALF GM在临床应用中面临标准化的问题，但是目前的研究认为在侵袭性肺部真菌感染的诊断中BALF GM比血清GM更敏感[20]。对于BALF GM的临界值在不同的文献中有不同的推荐，如Zou等[21]建议为1.0，而Heng等[22]建议为1.5。需要注意的是抗真菌治疗可显著降低血清GM试验的灵敏度[23]。部分β内酰胺类抗生素(如哌拉西林-他唑巴坦)、新生儿肠道内双歧杆菌定植、摄入含有GM的食物(如谷类食物和牛奶)以及一些非曲霉菌的菌种(如马尔尼菲篮状菌、白地霉、无绿藻菌、组织胞浆菌)会引起GM结果的假阳性。另外建议在治疗的过程中对GM进行动态检测，评估治疗的效果。若治疗期间，结果升高预示预后较差。但是，结果转阴，不能作为结束抗真菌治疗的孤立指标，应该结合影像、临床等综合评估。

2.4.4 曲霉菌抗体检测 曲霉IgG抗体是机体针对曲霉菌感染产生的特异性抗体。血清曲霉IgG抗体水平升高，通常提示曲霉菌感染。研究[24]显示慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis，CPA)患者中只有26.0%曲霉培养阳性，但99.0%的CPA患者存在曲霉菌特异性IgG升高。北京一项研究[25]指出，诊断CPA的曲霉特异性IgG(丹娜)的Cut-off值为89.3 AU/ml时，灵敏度和特异度分别为78.6%和94.4%。此外，曲霉IgG抗体检测不仅对肺曲霉病的早期临床诊断具有重要意义，其血清水平的变化能够直观地反映阳性患者抗真菌治疗的疗效[26]。2016年，美国传染病学会(Infectious Diseases Society of America，IDSA)和欧洲临床微生物学及传染病学会(European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases，ESCMID)与欧洲呼吸学会(European Respiratory Society，ERS)合作，发布了CPA诊断指南[27,28]。这两项指南均建议将曲霉IgG抗体检测作为诊断CPA的关键指标。

2.4.5 核酸检测 应用多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测真菌核酸相比传统的检测方法有更高的敏感性。采用通用引物或特异性引物的设计既可以发现常见致病真菌(曲霉菌、肺孢子菌),也可以发现少见或罕见真菌。以real-time PCR及相关技术为代表的分子诊断,已逐步成为感染性疾病诊断的重要方法，能提供更加快速的诊断，对于提早开始抗真菌治疗、改善患者预后及降低病死率有重要意义。PCR技术检测BALF标本用于辅助诊断侵袭性肺曲霉菌病具有很好的潜力[29，30]。以下三种情况均可作为诊断侵袭性真菌病的微生物学证据：(1)血浆、血清或全血连续2次或以上PCR检测阳性；(2)BALF 2次或以上重复PCR检测阳性；(3)至少1次血浆、血清或全血PCR检测阳性和1次BALF PCR阳性。另外需要强调的是，实验室必须对标本处理、保存、DNA提取和检测等全程标准化，并采取严格的防污染措施。

2.4.6 宏基因组测序(metagenomics next generation sequencing，mNGS) mNGS是一种可以直接从患者标本中进行泛核酸检测的方法，允许无差别检测所有微生物(如细菌、病毒、寄生虫和真菌)、抗体、毒力因子，甚至宿主生物标志物等[31]。对于呼吸道感染患者，若3 d内未通过传统实验室检查获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐留取呼吸道标本进行mNGS检测[32]。肺组织mNGS对真菌感染的灵敏度为57.1%，特异度为61.5%；对真菌的阳性预测值为44.4%，阴性预测值为72.7%[33]。标本的取样不规范，以及真菌细胞壁厚导致的DNA提取效率低，对mNGS在真菌检测中的灵敏度造成影响。对于呼吸道感染，mNGS在细菌、真菌等病原体的检测中尚不能准确判断菌群定植或感染状态，仍需依赖临床医师结合患者病情进行进一步分析[32]。综上，随着测序技术的进一步发展，以及更多的实践经验和评估，在未来尽管mNGS不太可能完全取代传统的病原体鉴定和抗生素敏感性检测，但必将为侵袭性肺部真菌感染提供更强的诊断能力。侵袭性肺部真菌感染诊断中不同实验室检测方法的特点见表1。

表1 侵袭性肺部真菌感染诊断中不同实验室检测方法的特点

续表1

3 结语

精准的实验室检查是实现侵袭性肺部真菌感染精准诊疗的前提和基础。循证医学数据表明准确、早期的病原真菌实验室诊断，有利于尽早开始靶向性抗真菌治疗，对改善患者预后、降低病死率有显著作用。目前实验室除了传统的真菌涂片及培养等传统的方法外，血清学检测在临床的应用越来越广泛，标本中真菌的核酸检测在临床也逐渐开始应用。充分了解每种实验室检测方法的优缺点以及检测性能，可以更好地帮助诊断侵袭性肺部真菌感染。在临床工作中将传统的检测方法与血清学检测、核酸检测联合应用可显著提高侵袭性肺部真菌感染的检测灵敏度，更好地区分感染和定植，从而实现精准的诊断和治疗，改善患者的预后。