补脑软胶囊对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

陈二林，李喜香*，吴国泰，马慧萍，潘从泽，李 翔

(1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 73000；3.中国人民解放军联勤保障部队第九四O医院，甘肃 兰州 730050)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种神经退行性疾病，现已成为严重危害老年人身心健康的常见病、多发病之一，至今西医临床尚缺乏特异性有效治疗药物，因此从中药中寻找和开发具有脑神经细胞保护作用的药物用于防治AD具有十分重要的意义[1-3]。研究表明，β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积是诱发AD的核心环节[4]。淀粉样斑块是一种不溶水的准晶体沉积，其主要成分为Aβ肽，由跨膜淀粉样前体蛋白断裂形成。Aβ沉积后具有很强的神经毒性，导致产生老年斑(SPs)、神经纤维缠结(NFTs)以及炎症反应，致使神经元变性凋亡，从而诱发AD[5-8]。

补脑膏是甘肃省中医院的医院制剂 (甘药制字Z04000828)，是在古方“佛手方 (当归、川芎)”的基础上，合用黄芪、赤芍、补骨脂、枸杞、淫羊藿、龟板、水蛭、仙灵脾、益母草、仙茅、黄精、甘草制成[9]，具有益气养血、填精补髓、化瘀通络的功效，用于脑外伤性神经损伤及后遗症，脑炎、脑膜炎后遗症，动脉硬化性脑损害，脑、脊髓变性性疾病，弱智儿童及脑性瘫痪等疾病的治疗，临床应用多年，疗效确切[10-12]。在前期研究过程中，笔者将补脑膏剂改进成软胶囊，主要由补脑浸膏粉250 g、大豆油250 g、微粉硅胶5 g等组成[13]。补脑软胶囊初步药效学研究显示，其对痴呆模型动物的学习和记忆功能具有明显的改善作用[14]。本研究利用Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞损伤，考察补脑软胶囊对损伤细胞的保护作用，为补脑软胶囊防治AD提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 细胞株

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株，来源于ATCC，购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.2 药物与试剂

补脑软胶囊(自制)；Aβ1-42(美国AnaSpec公司，批号：1855817)；多奈哌齐片(卫材药业有限公司，批号：1703055)；特级胎牛血清FBS(德国PAN公司，批号ST170307)；DMEM高糖培养基(Solarbio公司，批号：Hyclone003)；胰蛋白酶(北京赛诺浦生物技术有限公司，批号：PB180218)；青霉素、链霉素混合液(碧云天生物技术公司，批号：C0222)；细胞凋亡Hoechst33258染色试剂盒(碧云天生物技术公司，批号：C1017)。

1.3 主要仪器

SW-CJ-1FD超净工作台(苏州净化设备有限公司)；CO2细胞培养箱(北京瑞科中仪科技有限公司)；CKX41倒置荧光显微镜(北京瑞科中仪科技有限公司)； SpectraMax i3全自动荧光酶标仪(美国Molecular公司)；TG16-W微量高速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；01A-1电热恒温鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)；YXQ4-LS-50A立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限医疗设备厂)。

2 方法

2.1 细胞培养

SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素混合溶液的DMEM/F12完全培养液培养，置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中，待细胞浓度为80%～90%后传代，隔天换液1次，待细胞进入对数生长期即可用于实验[15]。

2.2 药物配制

称取补脑软胶囊内容物0.05 g，加4 mL PBS溶解，3 000 r/min离心10 min，取上清液，过滤除菌，取续滤液即得0.012 5 g/mL母液，用无血清培养基稀释，分别配制成1.25 mg/mL、1.25×10-1mg/mL、1.25×10-2mg/mL、1.25×10-3mg/mL、1.25×10-4mg/mL、1.25×10-5mg/mL的药液，备用。取Aβ1-42备用液，每支加入10 μL DMSO溶解至5 mmol/L，再加入490 μL PBS稀释至100 μmol/L/4 ℃孵育24 h后，14 000 g×10 min离心，取上清液，4 ℃避光保存，备用。取1片盐酸多奈哌齐称重，称取0.050 2 g(含1.8 mg多奈哌齐)，用1 mL DMSO溶解，3 000 r/min离心取上清液，PBS稀释4倍，过滤除菌，取续滤液得0.45 mg/mL的母液，备用。

2.3 Aβ1-42适宜浓度选择

将浓度为5×106个/mL的SH-SY5Y细胞接种于96孔板，待细胞生长汇合率达70%～80%后换为无血清培养基。培养4 h后，对照组加入无血清培养基，损伤组加入终浓度分别为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L Aβ1-42溶液，每组3个复孔[15]。培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8孵育1 h，采用酶标仪于450 nm波长处检测吸光度(OD)值。

2.4 补脑软胶囊内容物及多奈哌齐剂量选择

将浓度为5× 106个/mL的SH-SY5Y细胞接种于96孔板，待细胞生长汇合率达70%～80%后更换为无血清培养基[15]。培养4 h后，分别加入100 μL终浓度为1.25 mg/mL、1.25×10-1mg/mL、1.25×10-2mg/mL、1.25×10-3mg/mL、1.25×10-4mg/mL、1.25×10-5mg/mL的受试物药液，每组3个复孔。同时设置终浓度分别为0.004 5 mg/mL、0.002 5 mg/mL、0.001 mg/mL的多奈哌齐试验组，每组3个复孔。培养24 h后更换无血清培养基，每孔加入10 μL CCK-8孵育1 h，采用酶标仪于450 nm处检测吸光度(OD)值。

2.5 实验分组及处理

将细胞分为空白组、对照组、Aβ1-42模型组、多奈哌齐阳性组与补脑软胶囊内容物高、中、低剂量给药组。空白组加等量培养基，不接种细胞，将对数生长期的SH-SY5Y细胞以5× 106个/mL接种于96孔板，待细胞融合率为80%时，各组更换为无血清培养基，培养4 h，阳性组更换为含多奈哌齐的无血清培养基，给药组分别更换为含高、中、低剂量的补脑软胶囊内容物的无血清培养基。除对照组外，其余各组加入Aβ1-42溶液继续孵育24 h。

2.6 对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞形态及细胞存活率的影响

按照“2.5”项下方法分组给药，每组6个复孔，培养至细胞融合率达80%后，置于显微镜下观察细胞形态变化。更换培养基，每孔加入10 μL的CCK-8，37 ℃孵育1 h，采用酶标仪于450 nm处测定吸光度(OD)值，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

2.7 对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响

按照“2.5”项下方法分组给药，培养至细胞融合率达80%后，加入新鲜配制的4%多聚甲醛0.5 mL，于37 ℃固定细胞15 min，PBS液洗2次，加5 mg/LHoechst33258染色液染色5 min，PBS液洗2次后，用抗荧光淬灭封片液(20 mmol/L柠檬酸，50 mmol/L磷酸氢二钠，50%甘油，pH=5.5)封片后采用荧光显微镜观察、拍片[16]。

2.8 统计学处理方法

3 结果

3.1 补脑软胶囊内容物对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞形态的影响

显微镜下观察发现，对照组SH-SY5Y细胞形态正常，折光性强，轴突清晰可见，贴壁状态良好。模型组SH-SY5Y细胞折光度下降，突触收缩，贴壁状态不良，有许多细胞呈悬浮状。补脑软胶囊内容物组SH-SY5Y细胞形态改善，细胞突触结构较完整，细胞贴壁状态较好。见图1。

图1 各组 SH-SY5Y 细胞形态的改变

3.2 Aβ1-42适宜浓度筛选

如表1所示，随着Aβ1-42浓度的提高，细胞存活率逐渐降低，且Aβ1-42损伤组细胞存活率与对照组均有显著性差异(P<0.01)。说明Aβ1-42(1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)对 SH-SY5Y细胞有明显的损伤作用，其中Aβ1-4220 μmol/L诱导损伤适中，故选择20 μmol/L Aβ1-42作为诱导SH-SY5Y细胞损伤的最佳浓度。

表1 Aβ1-42浓度对SH-SY5Y细胞的影响

3.3 补脑软胶囊内容物及多奈哌齐剂量筛选

如表2所示，补脑软胶囊内容物在1.25×10-3～1.25×10-5mg/mL对SH-SY5Y细胞毒性损伤较小，在1.25～1.25×10-2mg/mL对SH-SY5Y细胞毒性损伤较大，因此选择1.25×10-3～1.25×10-5mg/mL作为受试剂量。多奈哌齐阳性组0.004 5 mg/mL对SH-SY5Y细胞毒性损伤较大，0.002 5 mg/mL、0.001 0 mg/mL对SH-SY5Y细胞毒性损伤较小，因此选择0.002 5 mg/mL作为受试剂量。

表2 补脑软胶囊内容物对SH-SY5Y细胞的毒性

3.4 补脑软胶囊内容物对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞存活率的影响

如表3所示，Aβ1-42损伤的SH-SY5Y细胞模型组吸光度明显低于对照组，表明细胞受到了损伤或部分细胞已经死亡。与模型组比较，补脑软胶囊内容物高剂量OD值低于模型组，补脑软胶囊内容物中剂量OD值高于模型组，但差异无统计学意义(P>0.05)；补脑软胶囊内容物低剂量OD值明显高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比较，阳性组吸光度值高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示补脑软胶囊内容物及多奈哌齐对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有一定的保护作用。

3.5 补脑软胶囊内容物对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响

采用Hoechst33258染色观察SH-SY5Y细胞凋亡情况，发现对照组细胞核呈现弥散均匀的淡蓝色弱荧光，而Aβ1-42模型组SH-SY5Y细胞核出现固缩形态和颗粒状荧光，给予高、中、低剂量(高：1.25×10-3mg/mL，中：1.25×10-4mg/mL，低：1.25×10-5mg/mL)补脑软胶囊内容物孵育后，细胞颗粒状荧光及固缩形态明显减少。见图2。

4 讨论

阿尔茨海默病( AD)严重影响人类晚年的生活质量，已经成为当今社会关注和科学研究的重点疾病之一。长期以来，老年痴呆发病机制形成了多种假说，β-淀粉样蛋白( Aβ)学说引起了众多研究者的关注[17-18]。该假说认为Aβ在AD的发生和发展过程中起到了关键作用。Aβ可诱发神经元细胞凋亡，从而引起神经细胞功能紊乱和死亡，最终导致AD的发生[16]。

图2 Hoechst33258染色观察细胞凋亡情况

本研究结果显示，SH-SY5Y神经细胞采用Aβ1-42造模损伤后，与空白组比较，细胞折光度下降，突触收缩，贴壁状态不良，细胞存活率下降，显示Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞AD体外模型构建成功。补脑软胶囊用药组显示细胞突触结构消失减少，细胞贴壁状态明显改善，细胞形态学显示补脑软胶囊对SH-SY5Y神经细胞具有保护作用。利用Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况，对照组细胞核呈现均匀的弱荧光，Aβ1-42模型组细胞核出现固缩形态和颗粒状荧光，补脑软胶囊用药组显示细胞核颗粒状荧光及固缩形态明显减少，表明补脑软胶囊可有效抑制Aβ1-42引起的SH-SY5Y细胞凋亡，对Aβ1-42损伤的SH-SY5Y神经细胞具有明显的修复和保护作用。