以淀粉为原料双酶法生产海藻糖的研究进展

曹 媛

（南京凯通粮食生化研究设计有限公司，江苏 南京210012）

海藻糖（C12H22O11）广泛存在于自然界中，是两分子D-吡喃葡萄糖的异头碳原子（C1）上的半缩醛羟基之间去水缩合而成的非还原性双糖，微甜，常以二水化合物的形式存在。海藻糖的生物保护机制显著，在一些恶劣条件下能够稳定细生命体的胞膜和蛋白质分子不变性失活，从而维持生物特征和生命过程[1]。海藻糖可以改善压力作用下益生菌的疏水性，并提高益生菌类饮料的储存稳定性[2]。海藻糖可以抑制细胞外冰晶对细胞的抑制作用[3]，从而作为保护剂在冷冻食品[5]和饲料[5]中使用。同时海藻糖在维持植物体内渗透压，参与信号转导过程等方面发挥了重要作用，对作物栽培和育种改良有着重要的意义[6]。鉴于上述特殊的生物保护特性，海藻糖在食品、医药、化妆品、保健品和农业等领域有着广阔的市场前景。

海藻糖的生产方法主要包括发酵法[7]、提取法[8,9]、酶合成法[10,11]和基因重组法[12,13]等。其中酶合成法根据所用原料的不同可以分为葡萄糖合成法、蔗糖合成法、淀粉合成法和麦芽糖合成法；葡萄糖合成法和蔗糖合成法普遍存在收率过低的问题。酶法根据是否磷酸化又可以分为磷酸化途径和非磷酸化途径，前者难以实现工业化，后者主要包括单酶法和双酶法。单酶法是指利用海藻糖合成酶将底物麦芽糖转化为海藻糖；双酶法指在两种酶的共同作用下将直链淀粉转化为海藻糖；文章重点介绍发展较早的以淀粉为原料的双酶法。

1 双酶法在日本的发展

酶法制备海藻糖的研究依据于海藻糖在自然界的合成促进。最早发现的海藻糖酶促途径常需要以磷酸盐为代表的高能化合物的参与，反应过程较复杂，不利于工业化。20世纪90年代，日本林原生化研究所和日本麒麟公司的研究者从节杆菌（Arthrabactersp.Q36）、嗜酸热硫化叶菌（Sulfolbusacidocaldarius）和硫矿硫化叶菌中纯化出和海藻糖形成相关的酶系统，并进一步探究该酶系统作用下的海藻糖合成机理。该酶系统包括低聚麦芽糖基海藻糖合成酶（Maltooligosyl Trahalose Synthase,MTSase,EC 5.4.99.15）和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶（Maltooligosyl Trahalose Trahalohydrolase,MTHase,EC 3.2.1.141），MTSase可以作用于DP≥3的麦芽寡糖、麦芽糊精或直链淀粉，在其末端生成具有海藻糖结构的а,а-1,1-葡萄糖苷键；MTHase将上述а,а-1,1-葡萄糖苷键特异性的从直链末端切掉转化成海藻糖，参见图1。该合成途径被称为TreY/TreZ途径[13]，因为有两种酶的协同参与，所以常被称为双酶法。双酶法可以使用多种淀粉作为底物，如小麦淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉和玉米淀粉等；酶反应后除海藻糖外还有葡萄糖、麦芽糖、麦芽寡糖、а-葡萄糖基海藻糖和а-麦芽糖基海藻糖等副产物，可以采用糖化酶（葡萄糖淀粉酶）将上述副产物转化为葡萄糖和海藻糖后再分离[15]。双酶法合成海藻糖的整个过程无需高能化合物的参与，对磷酸盐无依赖性，极具工业化潜力。

图1 淀粉双酶法生产海藻糖反应过程[2]Fig.1 Principle of trehalose production by double-enzyme method from starch[2]

日本是最早实现以淀粉为原料工业化生产海藻糖的国家。1995年，林原生化研究所利用双酶法工艺实现工业化生产海藻糖，比起早期的酵母提取法，双酶法的生产成本大幅度降低，使海藻糖的价格由每千克2万多日元下降到350日元；截至2000年底，年产量达到24000t，林原公司成为当时海藻糖最大的生产商。

最初的双酶法酶促反温度较低，容易出现杂菌污染、生产控制难度大的问题。林原公司不断完善双酶法工艺，发现制备了重组型耐热性海藻糖水解酶和耐热性非还原性糖质生成酶，其反应温度分别为75℃（pH值7）和60℃（pH值5.5）[16]；利用上述耐热型MTSase和MTHase，并配合使用淀粉脱支酶（异淀粉酶或直链淀粉酶）、葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、一种天然型或重组型环状糊精葡萄糖苷基转移酶（Cyclomaltodextrin Glucanotransferase，CGTase）或其突变体等[17]，海藻糖产率得到显著提高。酶促反应液经过灭酶、精制、浓缩后得到高纯度的海藻糖浆；并进一步采用控制冷却法得到二水合海藻糖结晶粉末[19]；CGTase参与下的反应液经过除酶、脱色脱盐及浓缩后，所得海藻糖浆的海藻糖纯度高达86%（以无水物计），必要时可以不用经过层析分离，直接进行结晶离心分离，固体产品中纯度为98%[20]。

2 双酶法在国内的研究进展

2.1 酶的提取和酶转化反应

鉴于淀粉原料来源广、价格低以及海藻糖的特殊生物功能和高经济价值等原因，淀粉双酶法生产海藻糖的技术一直受到关注。国内对海藻糖的研究和生产起步略晚，随着酶技术和基因科学的发展，酶法制备海藻糖的研究逐渐兴起，但对于双酶法的研究报道远少于单酶法，且研究方向集中在酶的制备提取和酶转化反应上。

1999年，黄日波等从硫矿硫化叶菌（Sulfolobus sotfataricus GX×05T）中克隆到MTSase和MTHase基因并表达成功。2000年，南宁中诺生物工程有限责任公司利用此酶系成功开发出酶法转化木薯淀粉生产海藻糖的工艺，使我国成为世界上第二个酶法工业化生产海藻糖的国家。

北京化工大学的孙长慧利用产MTSase和MTHase的微球菌，以淀粉为原料，在30℃、pH值8.0、反应时间24h和底物质量分数20%条件下，得到海藻糖质量浓度52.76g·L-1，淀粉转化率52.7%[21]。陈晓斌等将从嗜热硫矿硫化叶菌ATCC35092基因组中扩增得到编码MTSase和MTHase的基因并转入大肠杆菌重诱导表达，所得MTSase和MTHase的酶活产率分别为313U·g-1（wetcell）和403U·g-1（wetcell）；但在75℃、pH值5.0条件下时，海藻糖转化率最高仅为53.6%[22]。在工业上，不足60%的转化率难以满足生产需求，不具备竞争优势。同时，两种酶的制备技术难度较大、且反应温度普遍较低，前期报道的适用温度多在50℃以内，最高不超过60℃[13,18]，以早期Nakada等从节杆菌Arthrobacter SP.Q36中提取的野生MTSase和野生MTHase为例，其最适温度也分别为40和45℃。反应温度低，意味着在实际生产中容易染菌污染、加大了生产难度和成本，阻碍了双酶法的工业应用。为了提高酶活、底物转化率以及酶耐高温性能，近年来众多研究者采用基因工程手段改造或重建MTSase和MTHase，越来越多不同来源的低聚麦芽糖基海藻糖合成酶和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶被开发。

齐鲁工业大学的薛乐平通过插入不同的连接肽及不同的融合顺序，构建产MTSase、MTHase的氧化杆菌融合酶菌株，得到了两种酶的基因序列和编码，重组的MTSase和MTHase的酶活分别为17.85U·mL-1和15.16U·mL-1。只是在40℃、pH值7.0、反应24h、直链淀粉底物浓度4%条件下，海藻糖转化率仅为45.87%，有待提高[23]。江南大学的王魁等首次将分支节杆菌Arthrobacter ramosus S34来源的编码MTSase的treY基因和编码MTHase的treZ基因进行密码子优化后导入到大肠杆菌中表达，所得重组MTSase和MTHase的最适温度分别为45℃和55℃，最适pH分别为7.0和6.0，总底物转化率达到67.7%[25]。江南大学的吴世雄等将来源于嗜酸热硫化叶菌ATCC 33909的MTSas和MTHase在短芽孢杆菌中重组表达，并进行了酶转化实验，发现在60℃、pH值5.5的条件下海藻糖转化率达到80.2%[24]，酶的耐温性和活性都得到了显著提高。

江南大学的吴敬等提供一系列麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体，并通过在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达和发酵优化显著提高了酶的产量[26]；并且利用角质酶、芽寡糖基海藻糖合成酶和芽寡糖基海藻糖水解酶进行多酶复配提高底物利用率，将海藻糖的转化率提高了约5个百分点[27]。

除此之外，有研究采用酶固定化或细胞固定化技术来保护酶类，以提高酶的稳定性[28]。如采用海藻酸钙包埋麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，固定化后MTHase的最适反应温度和稳定温度都有所提高[29]。

利用基因技术构建高效高稳定耐温的MTSase和MTHase，对降低进一步完善双酶法生产工艺具有重要意义，上述研究成果虽然多属于实验室阶段，未见工业应用的报道，但为双酶法的完善和工业化提供了重要技术基础。

2.2 双酶法配套技术的发展

国内外对海藻糖制备的研究主要集中在上游的酶提取和酶转化反应上，对下游的海藻糖精制和分离提纯过程以及双酶反应之前的预处理过程研究报道较少。

江南大学的韩少卿等采用超滤、纳滤技术对海藻糖抽提液进行处理，通过选型优化，海藻糖总提取率高达85.6%[30]。李博等探讨了利用超滤-渗滤技术除去蛋白质、提取海藻糖的应用研究，经超滤-渗滤操作，海藻糖总收率在95%[31]。天津大学的郑辉杰等采用离子交换树脂对海藻糖提取液进行处理，以除去杂质盐类及色素，处理后提取液的电导率从1700μs·cm-1下降至40μs·cm-1，脱色率98%，海藻糖收率为94%[32]。杨亚威等研究了利用模拟移动床色谱分离海藻糖和葡萄糖的工艺过程，得到SMB谱分离的最佳工艺参数[33]。

台湾国立中兴大学研究了在葡萄糖酸酶和葡萄糖氧化酶催化下麦芽糖连续转化为葡萄糖和葡萄糖制备葡萄糖酸的过程，转化后的葡萄糖酸可以很容易的与海藻糖分离，为工业化纯化海藻糖提供一个新的方向[34,35]。基于该思路，台湾大叶大学建立了PTTS生物生产系统，利用葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化生成葡萄糖酸并经过间歇/连续离子交换过程，将海藻糖可成功分离、结晶，纯度为（92.6±0.02）%，回收率为94.2%[36]。

江南大学的田成福探讨了双酶反应之前将淀粉转化为麦芽糊精的转化工艺，优化了粗酶液转化淀粉的最优条件：pH值6.5、反应温度45℃，反应时间30h，底物DE值11.9，浓度为10%的淀粉液化液[37]；从预处理角度为提高双酶法生产效率提供了数据支撑。

3 双酶法生产工艺应用

双酶法制备海藻糖虽然具有原料淀粉便宜、无需高能量化合物等优点，但其反应时间长、不易实现高温反应易染菌；尽管国内有报道一些耐热耐酸性酶，但在确保酶活性或实现大规模生产上仍有技术难度。同时该工艺淀粉酶用量较大，对副产品的控制以及副产品中麦芽糖和海藻糖的分离难度相对较大，工艺过程较为复杂，世界上只有少数公司企业或机构拥有该生产工艺，以海藻糖主要生产国日本为例，已报道的日本海藻糖生产工艺见图2。

图2 双酶法淀粉制造海藻糖工艺流程框图Fig.2 Process of trehalose production from starch by double-enzyme with CGTase

该工艺以淀粉乳为原料，液化后在多种酶的协同作用下发生糖化酶促反应得到海藻糖和副产物葡萄糖，再经过灭酶过滤、脱色过滤、脱盐、浓缩得到高纯度海藻糖浆，根据需要色谱分离进一步提纯，或直接冷却结晶、离心、干燥得到结晶海藻糖。

南宁中诺生物工程有限责任公司采用双酶法工艺，以木薯淀粉为原料，由α-淀粉酶、普鲁兰酶分解为短链糊精后，经MTSase和MTHase作用转化生产海藻糖，再通过除酶、脱色、脱盐、分离、浓缩、结晶后可制成含量为98.0%的食品级结晶海藻糖和含量为99%以上的高纯度结晶海藻糖。2002年，我国结晶海藻糖产量200t，价格为79元·kg-1，海藻糖工业化生产在国内正式拉开序幕。

此后国内报道的工业化生产海藻糖主要以单酶法为主，双酶法完整工艺过程的公开报道多在实验室水平上或者中试规模上。2014年，山东天力药业有限公司完成了淀粉法生产海藻糖项目的中试，并在专利CN103205475A中介绍了利用高温淀粉酶、新型MTHase和MTSase以及普鲁兰酶以淀粉为原料生产海藻糖时的反应工艺条件，至2020年天力药业的海藻糖产量达3000t。专利CN108130350A公开了一种高含量、颗粒度小的海藻糖制备方法，制备过程包括：淀粉乳制备、液化、双酶解、过滤去蛋白、脱色、脱盐、纳滤和色谱分离提纯、浓缩结晶和分离干燥制得成品，海藻糖含量大于99.7%[38]。

4 结论与展望

双酶法起源于日本，具有原料便宜易得、无需高能化合物等优点，国际上已经具备较完整的制备工艺。国内对双酶法工业化应用报道较少，但双酶法作为最早实现工业化酶法生产海藻糖的技术，或被忽略或低估，仍然具有工业价值。随着基因工程技术日趋成熟，利用生物信息学和基因技术，通过基因重组或点突变技术对MTHase和MTSase进行改造，以期获得酶活和稳定性更高的MTHase和MTSase，从而减少双酶法反应时间、提高反应温度、降低染菌可能和降低生产成本，是目前也是未来双酶法的一个主要研究方向，对改进双酶法工艺具有重要意义。随着生物制备下游分离精制技术的发展，尤其是模拟移动床色谱分离技术的发展，使海藻糖和麦芽糖等副产品的高效分离成为可能。可以预见，在我国有望实现双酶法的进一步工艺完善和工业应用。