一种用于去除病理切片中水珠的方法

武振汝，陈梦琳，李 丽，石毓君，步 宏,2

近年随着我国医学科研水平的提高，病理技术在科学研究中越来越受到重视，由于科研病理样本来源及染色复杂，往往不能像病理科一样完全使用全自动染色机染色，多采用手工染色。病理切片制作过程中往往会出现脱水液更换不及时，或封片剂开封后保存不当，造成脱水不足，或封片剂过干，使封片剂不能完全覆盖组织而造成盖玻片与组织之间出现细小间隙影响折射率，产生类似“水珠”一样的间隙，严重影响阅片和采图，成为不合格的病理切片。日常工作中此类情况往往成批出现，如重新制片将造成时间和试剂的严重浪费。本实验室通过多次实践摸索，取得较好效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集有封片问题的病理切片2 302张，二甲苯、无水乙醇均购自成都科隆公司，封片剂、载玻片均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，盖玻片购自江苏世泰公司。

1.2 方法(1)问题切片脱胶：将问题切片浸泡在二甲苯中2天，待盖玻片松动后手动取下盖玻片，继续在二甲苯中浸泡3 h，待切片上的胶完全脱掉后从二甲苯中取出，置于通风橱中待二甲苯完全挥发。(2)切片水化：将无水乙醇用双蒸水准确配制成85%乙醇1缸，95%乙醇2缸，再准备无水乙醇2缸。将脱胶完全的切片依次浸入无水乙醇2缸，95%乙醇2缸，85%乙醇1缸中；免疫组化染色切片每缸2 min；HE或PAS染色切片每缸5 s行乙醇梯度水化。(3)切片再次脱水透明：切片经85%乙醇1缸，95%乙醇2缸，无水乙醇2缸梯度脱水；免疫组化染色切片每缸2 min；HE或PAS染色切片每缸5 s；二甲苯中透明2 min。(4)切片再次封片，透明后的切片直接用封片剂封固，待封片剂凝固后显微镜下采图或数字病理切片扫描仪扫片。

2 结果

所有切片经过脱胶、水化、又脱水后制作的切片HE染色胞核清晰，胞质鲜亮；经PAS和免疫组化染色，切片仍保留原来颜色，无脱色现象，“水珠”消退，切片制作合格(图1、2)。

图1 A.小鼠肝脏PAS染色(处理前)，细胞核周边出现水珠(箭头)，黑色不透明；B.同一张切片经过处理再次封片(处理后)，小鼠肝脏PAS染色，细胞核上黑色水珠消失 图2 A.小鼠肝脏免疫组化Glutamine Synthetas染色(处理前)，阳性位置出现多个黑色水珠(箭头)；B.同一张切片小鼠肝脏免疫组化Glutamine Synthetas染色(处理后)，胞核清晰

3 讨论

制作一张合格的切片是病理实验研究的前提，但在实际病理切片制作过程中难免会出现脱水液更换不及时，或者由于天气原因，特别是夏季空气湿度大，造成乙醇脱水浓度不达标，使病理切片脱水不足；或者封片剂开封过久液体挥发，导致封片剂不能完全覆盖组织，组织切片与盖玻片之间出现细小缝隙，出现类似“水珠”的空隙，严重影响阅片效果和采图质量。虽然在病理切片制作中封片步骤有很多方法避免“水珠”和气泡的产生[1-2]，但均未能完全避免，特别是科研病理样本来源复杂，有人和动物来源的区别，动物来源样本往往又经过各种实验处理，从而造成病理切片制作过程中脱水和封片步骤的质控困难，往往会出现成批次的病理切片封片问题。如果将问题切片重新制作，会造成时间、样本、试剂和耗材的严重浪费。另外，有的动物模型难以建立，样本十分珍贵。为了补救封片中出现的问题，本实验室借鉴文献报道[3]，经长期摸索和多次实验将问题切片脱胶后水化，再次脱水及时封固，有效地解决了水珠的问题。

本研究室长期从事科研病理实验，在日常工作中难免出现病理切片封片问题。出现切片封片问题，通常的做法有两种：(1)若切片比较大，封片瑕疵不严重时，则可避开封片瑕疵区域采图和阅片。(2)若切片非常小或者封片瑕疵严重时，则丢弃切片，重新制作。根据经验用数字病理切片扫描仪行全切片数字扫片时，无论封片瑕疵有多小均会影响扫片结果的清晰度，所以数字病理切片扫描仪要求病理切片必须完整清晰，不能有任何瑕疵。因此制作一张高质量切片，需要多次操作，但有些样本较小，例如类器官石蜡块，全部切完不足30张，当出现封片问题时只能从问题切片进行补救，不能弃之重新培养类器官。本研究室经过多次尝试和验证，发现脱胶处理再封片的方法在补救问题切片时非常有效，值得临床推广应用。