红糖、白砂糖、赤砂糖与黑糖的HPLC指纹图谱与化学模式识别

蔡玮琦，左雯雯，陆 杨，黄胜良，李存玉,3，郑云枫,3，彭国平,3,*

（1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.江苏融昱药业有限公司，江苏 淮安 223200；3.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023）

红糖是由甘蔗的汁液经过简单加工后制作而成的产物，在不同地区有不同的名称，如“jaggery（棕榈糖）”、“panela”、“non-centrifugal sugar（非离心糖）”，并且生产工艺也略有不同[1]。在明代宋应星所著的《天工开物》卷六（《甘嗜》）中，就已详细记述了种蔗、制白糖与红糖的方法[2]。现今，由于糖的过度摄入，导致了肥胖等一系列问题，甚至产生成瘾性[3]。人们开始更多的将关注点放在了功能性红糖、黑糖上，不仅具有甜味，且含有大量的生物活性成分，可以增强免疫力、保护细胞、降低糖尿病和高血压的发病率等[4-6]。有学者已经提出是否可以将红糖作为白砂糖的替代品[7]，或开发富含植物源性生物活性成分的糖类增值产品[8]，以期获得更高的商品价值。

白砂糖与赤砂糖中所含的酚类物质，主要是甘蔗中的天然色素，赤砂糖中的酚类物质稍多，约为白砂糖的1～3 倍，但在实际生产加工过程中，糖厂会去除酚类化合物使产品更加稳定[9]。红糖与黑糖在熬制过程中，发生美拉德反应，改善风味和感官质量的同时也更多的产生了具有抗氧化、抗炎等功能的多酚类和黄酮类的化合物[10-12]，并且由于黑糖熬制时间更久且含有丰富的铁元素，使其呈现出黑褐的颜色[13]。如今，许多糖类的关联产品应运而生，消费者追求更高品质的糖，但仍然无法区分市面上销售的糖的种类[14]，相当多关于糖类的错误信息仍然需要纠正。

本研究在确立的红糖质量标准基础上[15]，通过对红糖、白砂糖、赤砂糖和黑糖的非糖部分进行的指纹图谱测定，并通过指纹图谱结合模式识别（聚类分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交最小二乘法判别分析）进行综合分析[16-19]，将白砂糖、红糖、赤砂糖以及黑糖进行区分，以期为其质量控制与评价、生产以及消费者的选择提供依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、三氟乙酸（均为色谱纯） 德国Merck公司；反-乌头酸（批号：10210049）、顺-乌头酸（批号：10213040） 美国Alfa Aesar公司；重蒸水由Milli-Q超纯水仪制得，其余试剂均为分析纯。30 批次样品信息见表1。

表 1 30 批红糖样品厂家及批号Table 1 Manufacturers and batch numbers of 30 batches of samples tested in this study

1.2 仪器与设备

Alliance e2695高效液相色谱仪（配有Waters 2998二极管阵列检测器）、Empower 3色谱工作站 美国Waters公司；Triple TOFTM5600型质谱仪 美国AB Sciex公司；FA1004型万分之一电子天平、Anke TGL-16B台式离心机 上海安亭电子仪器厂；B807438265十万分之一电子天平 美国Mettler-Toledo公司；KH-250B型超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

采用Durashell C18-AM亲水性色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行分析，以乙腈（A）-0.1%三氟乙酸（B）为流动相，梯度洗脱见表2，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL，检测波长210 nm。

表 2 梯度洗脱条件Table 2 Gradient elution conditions

1.3.2 标准品溶液的制备

精密称取顺-乌头酸、反-乌头酸对照品适量，加水溶解，即得。

1.3.3 供试品溶液的制备

取本品1 g，精密称定，于具塞锥形瓶中，加水10 mL，超声处理（功率250 W、频率40 kHz）30 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液即得。

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子源，正离子模式；质量扫描范围m/z50～2 000；喷雾电压5 500 V；解簇电压100 V；碰撞电压40、20 V；离子源温度600 ℃；雾化气压力413.7 kPa；辅助加热气压力413.7 kPa；气帘气压力275.8 kPa。

1.3.5 精密度、重复性和稳定性测定

称取同一批次红糖样品6 份（S10），并按照1.3.3节供试品溶液制备方法进行制备，取其中一份样品连续进样6 次，取另一份样品分别在0、2、4、8、12、24 h的不同时间点进样检测，按照1.3.1节指纹图谱色谱条件分别进行检测，选择9号峰作为参照，并分别计算该样品中共有峰的相对峰面积和相对保留时间，并计算精密度、重复性和稳定性的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

2 结果与分析

2.1 相似度分析

经测定精密度、重复性、稳定性检测RSD均小于3%，仪器良好。将30 批样品按1.3.3节方法制备供试品溶液，在1.3.1节条件下进样，对其紫外色谱指纹图谱相关参数进行比较。将30 批图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）”。结果，红糖相似度大于0.995，白砂糖相似度均小于0.261，赤砂糖相似度为0.171～0.881，批次间的差异很大，而黑糖的相似度为0.800、0.983与0.983。考虑到4 种糖之间成分差异性较大，而除赤砂糖外，同种之间差异较小。因此，不能建立同一指纹图谱，而应各自进行分析比较。

2.2 指纹图谱的建立

将30 批图谱按类别分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）”进行分析，结果见图1。红糖（S1～S10）的相似度为0.994、1、0.999、0.983、1、1、0.999、1、0.959、0.989；白砂糖（S11～S17）的相似度为0.955、0.981、0.979、0.979、0.980、0.979、0.658；赤砂糖（S18～S27）的相似度为0.997、0.953、0.989、0.944、0.839、0.998、0.979、0.959、0.976、0.993；黑糖（S28～S30）的相似度为0.947、1、0.999。可以看出，同种糖成分接近，而4 种糖间差异较大。

图 1 4 类糖高效液相色谱指纹图谱Fig. 1 HPLC fingerprints of 30 samples of four types of sugars

2.3 共有峰的标定与分析

根据10 批红糖样品、7 批白砂糖样品、10 批赤砂糖样品以及3 批黑糖样品分别生成相对应的对照图谱，由于4 种糖在同类别中的差异不大，相似度很高，所以可以将对照图谱代替各类样品进行比对，结果见图2。按保留时间排序，共有17 个峰。红糖中共有峰13 个，白砂糖中共有峰1 个，赤砂糖中共有峰7 个，黑糖中共有峰17 个。其中2、5、6、7、9、14、16号峰为红糖、赤砂糖和黑糖共有峰，红糖和黑糖的6号和9号峰较高。根据图谱可以看出，赤砂糖更接近于白砂糖，除糖类以外其他成分的含量很低；红糖与黑糖基本类似，共有峰14 个，这与相似度结果基本一致。

图 2 4 种糖对照图谱Fig. 2 Typical chromatograms of four types of sugars

2.4 聚类分析

将30 批样品色谱图数据量化后导入SIMCA 14.1统计软件中，以“Single linkage”模式为距离计算方式，以“size”为分类方式，对数据进行系统聚类，结果见图3。4 类糖基本可以单独分类。当欧氏距离为4.5时，黑糖就可以与其他3 类糖进行区分，当欧氏距离为4时，可以分出红糖和白砂糖与赤砂糖（S11～S27）两大类。并且，当度量距离为0.5时，赤砂糖与白砂糖基本分开，但S19、S21和S22均被归类为白砂糖，所以再次证明了市场上的某些品牌的赤砂糖与白砂糖并无明显差异。

图 3 30 批样品聚类树状图Fig. 3 Dendrogram obtained from cluster analysis of 30 batches of samples

2.5 PCA结果

图 4 30 批样品PCA图Fig. 4 PCA plot for 30 batches of samples

将30 批样品色谱图数据量化后导入SIMCA 14.1统计软件中，若在该保留时间下无对应色谱峰，则将峰面积定为0。PCA采用了无监督模式识别，选择前2 个PC进行区分。具体结果见图4。以中轴为分界，左侧为白砂糖和赤砂糖；右侧为黑糖与红糖，且黑糖与红糖也可以区分开，以x轴为分界时，上方为黑糖，下方为红糖。

2.6 正交最小二乘法判别分析

图 5 变量重要性投影图Fig. 5 VIP plots of OPLS-DA for brown sugar versus red granulated sugar and black sugar

通过聚类分析、PCA以及相似度分析后，可以看出白砂糖与赤砂糖并无太大区别，可以将其归为一类。所以，为了更进一步的看出红糖与赤砂糖以及红糖和黑糖之间的成分差异，选择正交最小二乘法判别分析，生成变量重要投影，对这3 类糖进行两两分析，结果见图5。以变异权重参数（variable importance in projection，VIP）值大于1作为标准，得出各标定峰对于区分作出的贡献程度。

在红糖和赤砂糖的对比中，起主要区别作用的峰分别为峰9以及峰6（按影响大小排序），且2 个峰为红糖与赤砂糖的共有峰。在红糖和黑糖进行对比时，峰13、峰10、峰15、峰11（按影响大小排序）的贡献较大。4 个峰均为黑糖独有峰。因此，可以据此6 个峰，对几种糖类样品进行鉴别。

2.7 共有峰定性分析

为了进一步确定共有峰成分，采用高效液相色谱-串联质谱[20-21]结合对照品进行比对。9号色谱峰成分：高分辨四极杆飞行时间质谱给出其准分子离子峰m/z175.2[M+H]+，确定其分子式为C6H6O6。1H核磁共振（nuclear magnetic resonance ，NMR）（D2O，500 MHz），δ3.890（1H，d，H-2），δ4.878（1H，dd, H-3），δ7.051（1H，s，H-1）。13C NMR（D2O，125 MHz），δ33.36（C-4），δ130.66（C-2），δ139.06（C-3），δ168.77（C-4），δ169.52（C-6），δ174.69（C-5）。上述1H NMR和13C NMR数据与SciFinder数据库中的反-乌头酸的数据基本一致，故鉴定该化合物为反-乌头酸，结构见图6。

图 6 反-乌头酸结构图Fig. 6 Structure of trans-aconitic acid

进一步，采用反-乌头酸和顺-乌头酸对照品进行标定，红糖对照图谱中特征峰6号和9号的成分确认，见图7。

图 7 红糖、黑糖对照图谱特征峰的成分确认Fig. 7 Confirmation of the characteristic peaks of brown sugar and black sugar

3 讨论与结论

许多红糖相关的产品不断开发出来，仅红糖本身的分类较多，许多红糖标注古法制造，亦或是原生态红糖，以求提高产品价值[7-8,22-23]。市场上主要存在的赤砂糖、红糖以及黑糖，价格和质量参差不齐，没有统一标准，为消费者的选择带来了很大困扰。

本实验选择课题组前期建立的药用辅料红糖紫外指纹图谱[15]，较为全面地考察4 个不同品种市售的糖的成分以及含量，并且通过化学模式识别，判断4 类糖成分是否有明显差别。

结果表明，赤砂糖和白砂糖基本一致，与红糖和黑糖的差异明显，成分主要差异在峰6和峰9上。红糖与黑糖成分类似，但仍能够通过峰13、峰10、峰15、峰11（按影响大小排序）明显区分。

白砂糖主要以甘蔗、甜菜或原糖为原料，通过榨汁、过滤等一步或两步沉淀后得到的。而赤砂糖则是生产白砂糖时的副产品[24]，这类赤砂糖在市场上售卖时，也标注为红糖。古法或者纯手工制作的红糖从榨汁到过滤熬糖、起糖的整个过程没有水参与，保留了甘蔗中丰富的营养物质的同时，口感香气更佳[25-26]。黑糖则是熬制时间更久的红糖，在相应的国家行业标准中，黑糖的执行标准和要求比红糖更高。Qu Ruijing等[27]在甘蔗汁的浑浊沉淀中分析出，其主要是多糖、蛋白质、酯类、胶体和多酚，并有少量的无机元素，Wang Liwen等[28]发现甘蔗提取物中主要成分为表儿茶素的多酚物质，可以抗组织纤维化。红糖和黑糖在生产加工时，并不需要彻底精制或是沉淀过滤，其甘蔗原有的多酚类物质保留较多，从生产工艺与化学模式识别的结果结合推测分析，不同糖的加工生产工艺以及熬制的时间可能是造成其成分差异以及药理活性差异的原因之一。这为后续的进一步研究提供了方向和思路。

几种糖的差异以及区分已经有较多研究[29]，但并没有通过数据证实其从成分含量上的具体区别。并且，市面上也存在售假或者虚假宣传的现象[30-31]，白砂糖与赤砂糖主要满足的顾客需求与红糖和黑糖有着明显差异，广大消费者应该注意所购买的糖是否达到预期购买愿望，满足自身需求。

本实验建立红糖、白砂糖、赤砂糖、黑糖的指纹图谱，并通过化学模式识别（聚类分析、PCA和正交最小二乘法判别分析），发现白砂糖与赤砂糖较为相似，赤砂糖S19、S21和S22在聚类分析时可归为白砂糖。赤砂糖与红糖、黑糖之间的差异较大，通过峰6与峰9的含量高低可以进行区分；红糖与黑糖较为相似，有13 个共有峰，但可以通过是否有峰13、峰10、峰15、峰11（按影响大小排序）进行区分。该方法为红糖、白砂糖、赤砂糖、黑糖的鉴定、区分以及品质评价提供了新的思路。