分子印迹阵列固相微萃取用于检测果蔬中多种有机磷农药残留

楚耀娟，张雪娜，向孝哲，李秀娟,*

（1.华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 430070；2.宁波谱尼测试技术有限公司，浙江 宁波 315040）

有机磷农药（organophosphorus pesticides，OPPs）的分析检测一直都是科学工作者研究的重点与热点[1-4]。传统的色谱方法，具有灵敏度高、分离效果好、重复性好等优点，但设备昂贵，前处理方法复杂、耗时长且往往不允许现场检测。生物传感器选择性高，可以反复多次使用，分析速度快、仪器体积小，适合现场测定[5-7]，但是生物传感器目前仍存在纯化成本高、热稳定性差和准确性不足的问题[8]。除此之外，传感器往往是在预处理好的样品中应用，而且分析物仅限于一种或几种农药[9-12]。因此，OPPs的常用检测方法仍然是基于色谱法，但是样品必须经过一系列复杂的前处理，所以，发展操作简单快速、高灵敏度、高选择性、高效率、低成本的前处理技术是目前农药残留检测工作的首要任务。固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）装置小巧便于携带，操作简单，易于与多种仪器联用而且容易实现分析自动化，将萃取装置带回实验室或使用便携式仪器还可进行现场测定[13-15]。

近年来，分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）被引入到SPME涂层材料中，使SPME在食品、药物和生物样品等[16-20]复杂基质中对目标分子和结构类似物具有更高的选择性和灵敏性，并且具有良好的物理和化学稳定性[21]。但是传统的SPME萃取头固定相体积有限，样品容量有限，影响方法的灵敏度和分析通量。增加涂层的厚度是提高SPME涂层萃取量的有效方法之一，但该方法在提高萃取量的同时，也延长了达到萃取平衡所需的时间，从而影响整体分析效率。用多根萃取头代替单一萃取头的SPME装置是一种很好的选择，可以在不影响SPME优势的情况下提高灵敏度。Lee等[22]同时使用4 根萃取头（50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS））从单个样品的顶空萃取香气成分，以提高香气物质的灵敏度。结果表明，萃取化合物的总峰面积随萃取头数量的增加而增加。Hu Yuling等[23]建立在线管内SPME方法，以PEEK管为在线萃取单元，将氧氟沙星和磺胺二甲嘧啶2 种分子印迹萃取头装在PEEK管内，同时萃取两类抗生素药物，发现这种装置可以同时富集复杂样品中的目标分析物。这些研究表明，在不增加涂层厚度的情况下利用多根萃取头组装在一起，构建外观与传统SPME装置相同的分子印迹阵列SPME装置，不仅可以增加萃取容量，还可以实现复杂体系多目标物并行处理，降低方法的检出限，提高分析通量。

本实验分别以水胺硫磷、二嗪农为模板分子，聚乙二醇为功能单体，采用溶胶-凝胶法制备2 种MIP萃取头，构建分子印迹阵列SPME装置。前期研究[24-25]已经证实了这2 种MIP萃取头分别对模板分子及其结构类似物具有良好的选择性、热稳定性（约350 ℃）和化学稳定性。本实验将重点研究分子印迹阵列SPME装置的选择性以及萃取性能，并将其应用于蔬菜和水果中常见的5 种OPPs的萃取，拟建立果蔬中多种OPPs残留的检测方法，实现复杂基质中OPPs的高通量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果、马铃薯均购自当地超市。丙酮、乙酸乙酯、无水硫酸钠、聚乙二醇20000（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；水胺硫磷标准品（纯度＞97%）百灵威科技有限公司；二嗪农、喹硫磷、甲基对硫磷和甲基嘧啶磷标准溶液（0.1 mg/mL，1 mL） 中国计量科学研究院。实验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

SP-6890A型气相色谱（gas chromatography，GC）仪山东鲁南瑞虹化工有限公司；N2000色谱数据工作站浙江大学智达信息工程有限公司；SE-54毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 µm） 兰州中科安泰分析科技有限公司；CAN型氮气氢气一体机 武汉科林普丰仪有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器郑州长城科工贸有限公司；KQ-50DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TG-16G型离心机上海安亭仪器有限公司；自制SPME手柄；商用SPME手柄、商用50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB和85 μm聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理及溶液配制

样品预处理：分别取100 g样品可食部分切碎，加入50 mL超纯水，高速匀浆，放置于棕色瓶中，密封，置于4 ℃冰箱保存。

挥干标准溶液中的溶剂，用甲醇配制农药混合标准溶液，各物质质量浓度分别为二嗪农、甲基嘧啶磷、喹硫磷均为0.005 mg/mL；甲基对硫磷质量浓度为0.01 mg/mL；水胺硫磷质量浓度为0.05 mg/mL，置于4 ℃冰箱保存。标准工作溶液根据需要用甲醇稀释。

1.3.2 阵列SPME装置及对比装置的研制

水胺硫磷分子印迹萃取头（isocarbophos molecularly imprinted polymers，I-MIP）、二嗪农分子印迹萃取头（diazinon molecularly imprinted polymers，D-MIP）和非分子印迹萃取头（non-imprinted polymers，NIP）参照文献[24,26]制备，涂层厚度约为32 μm。选择2 种印迹萃取头各两根，安装在自制阵列手柄上，构建分子印迹阵列SPME装置。为考察该阵列装置的萃取性能，分别构建装有厚度32 μm I-MIP、D-MIP及NIP萃取头的单根SPME装置，及装有2 种印迹萃取头的双根SPME装置（D-IMIP）。各装置均在GC进样口中于N2保护下250 ℃老化2 h，280 ℃老化0.5 h，然后在醋酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液中洗脱，重复操作直至解吸萃取头时无明显杂峰。

诺亚方舟是虚构的故事，第一，是由在事实上的不可能作证明；第二是它是承继的亚述大洪水故事的传说。《摩西五经》后面的书目记录了以色列对亚述文明的传承：如戴丽所译《两河流域神话：创世、洪水、吉加美士史诗等》、阿斯曼所著《埃及人摩西：西方一神教对埃及的记忆》、克罗斯所著《迦南神话与希伯来史诗》，等等。

1.3.3 SPME程序及GC条件

SPME萃取在10 mL萃取小瓶中进行，采用顶空萃取方式，样品量为4 mL，NaCl加入量为0.4 g/mL，70 ℃萃取40 min后于GC进样口250 ℃解吸8 min。分子印迹阵列萃取头性能评价时，5 种OPPs加标质量浓度为甲基对硫磷50 μg/L，水胺硫磷250 μg/L，二嗪农、甲基嘧啶磷和喹硫磷的质量浓度均为12.5 μg/L。高质量浓度加标水平各物质质量浓度为上述值的5 倍。

SE-54毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 µm）；GC以高纯氮气为载气，柱头压为0.03 MPa，氢气0.02 MPa，空气0.04 MPa，尾吹0.02 MPa；不分流进样；进样口温度250 ℃；氮磷检测器温度270 ℃，铷珠电流3.2 A。柱室升温程序：初温80 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升到100 ℃，以5 ℃/min升到120 ℃，再以8 ℃/min升到180 ℃，保持2 min。

2 结果与分析

2.1 2 种分子印迹涂层的选择性

表 1 2 种印迹涂层的选择性Table 1 Selectivity of two kinds of MIP-coated fibers

印迹因子（imprinting factor，IF）是MIP萃取头与NIP萃取头对目标物所得萃取峰面积的比值。IF大于1.0，说明MIP萃取头对目标物具有一定的选择性；IF越大，表示选择性越强，识别效果越好[27]。如表1所示，I-MIP涂层对其模板分子水胺硫磷IF为1.50，D-MIP对其模板分子二嗪农IF为1.66，与其他类似方法制备的溶胶-凝胶MIP涂层相似[26,28]。对于D-MIP，由于甲基嘧啶磷与二嗪农的结构相似，均含有嘧啶环结构、磷脂基团，IF较高为1.61；对于I-MIP，除喹硫磷以外，其他物质的IF都较接近，主要原因是这些物质结构较为相似。总体来看，这2 种MIP萃取头对OPPs都表现出一定的萃取选择性。

2.2 萃取能力

2.2.1 自制阵列SPME装置和商用萃取头萃取率比较

图 1 阵列SPME装置、NIP及3 种商用萃取头对OPPs萃取率比较Fig. 1 Comparison of extraction efficiencies of five pesticides with array-SPME device, NIP fiber and three commercial fibers

从图1可以看出，阵列SPME装置对5 种有机磷的萃取效果远大于NIP及3 种商用SPME萃取头。由于溶胶-凝胶材料具有优异的性能，即使NIP涂层的厚度只有32 μm，远低于商业萃取头的厚度，也显示出很好的萃取能力。

2.2.2 不同SPME装置对农药萃取率的比较

图 2 不同萃取装置萃取率比较Fig. 2 Comparison of extraction abilities of different devices

如图2所示，除水胺硫磷和二嗪农外，其他3 种有机磷的响应值随着萃取头根数增加，均有不同程度的增大，与Lee等[22]的研究结果类似。对于2 种模板分子，2 根萃取头装置表现出很高的萃取能力，萃取率远优于单根萃取头，但萃取头由2 根增加到4 根，装置对二者的萃取量并没有显著增加，原因可能是从单根增加到2 根后，装置已经将样品中的绝大多数目标物萃取出来，再增加萃取头数量时，响应值增加不明显。

图 3 高质量浓度时2 种SPME装置萃取率比较Fig. 3 Comparison of extraction efficiencies of two SPME devices for high spiked levels

2.2.3 各装置对非结构类似物的萃取率

选取4 种与模板分子结构差异较大的物质间二甲苯、2-辛醇、癸醛和辛酸乙酯作为参照物，评价装置的选择性。结果见图4。I-MIP与NIP对这些参照物的萃取效果相当，说明MIP涂层对4 种参照物是非特异性识别萃取，但随着萃取头数目的增加，萃取率显著增加。

图 4 不同萃取装置对参照物的萃取率Fig. 4 Comparison of extraction efficiencies of reference materials using different SPME devices

2.3 萃取动力学

如图5a所示，对于单根非印迹萃取头，大多数目标物在萃取时间为60 min时接近萃取平衡。如图5b所示，对于阵列SPME装置，萃取时间达到40 min后，OPPs均增加缓慢，萃取时间为50 min时，5 种农药萃取量略有波动但基本稳定。与单根非印迹萃取头相比，阵列SPME装置达到平衡所需时间缩短，这可能是由于阵列SPME装置萃取率大于单根非印迹萃取头，大大增加了传质速率，加快了萃取平衡。对于阵列装置，萃取时间40 min与50 min萃取量差别不大，考虑到分析时间和分析通量的问题，选择萃取时间为40 min。对于单根非印迹萃取头，50 min时萃取量比40 min增加明显，但是即使是50 min的萃取量也比阵列装置的小得多。综合考虑，所有实验的萃取时间均为40 min。

图 5 单根非印迹萃取头（a）和阵列SPME装置（b）对5 种农药的萃取时间曲线Fig. 5 Extraction time profiles of five pesticides with single NIP fiber (a)and array-SPME device (b)

2.4 方法评价

表 2 线性范围、相关系数、检出限和精密度Table 2 Linear ranges, correlation coefficients, and precision of the proposed method and its comparison with other methods in detection limits

在苹果基质中，在分子印迹阵列SPME装置最优条件下，采用顶空SPME与GC联用的方法测定5 种OPPs的线性范围、检出限和相对标准偏差，如表2所示。阵列SPME装置对OPPs有较高的萃取率，方法的线性范围宽，线性相关系数好，5 种OPPs的检出限低（0.002 8～0.043 6 μg/kg），连续5 次重复操作所得相对标准偏差为4.6%～11.7%，检出限低于其他方法。方法的检出限远低于GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》。

以回收率评价方法的准确度，用本研究建立的方法检测市场上购买的果蔬，均未检出OPPs残留。在样品中添加OPPs，考察方法的回收率和精密度。分别在苹果和马铃薯基质中添加高、中、低3 个水平的加标量，测定其加标回收率，2 种基质、3 个加标水平下的回收率在78.7%～122.8%之间，表明本方法具有良好的可靠性，结果见表3、图6。

表 3 加标苹果和马铃薯样品回收率Table 3 Recoveries for five pesticides in spiked apple and potato samples

图 6 单根非印迹萃取头和阵列SPME装置与GC联用检测苹果中加标农药谱图Fig. 6 SPME-GC chromatograms of spiked apple samples using single NIP extraction fiber and array-SPME device

3 结 论

本研究构建一种分子印迹阵列SPME装置，用于选择性萃取果蔬样品中的痕量OPPs多残留。与传统的分子印迹SPME装置相比，该装置增加了萃取容量，提高了方法的灵敏度，降低了检出限，增加了分析通量，准确度高，选择性和重复性好，可以实现复杂体系多目标物并行处理。该分子印迹阵列SPME装置为在复杂基质中对多目标物进行分离测定提供新思路。