气相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱测定植物油中17 种邻苯二甲酸酯类残留量

孟志娟，黄云霞，李 岩，孙文毅，王 东，李 强，范素芳，张 岩

（河北省食品检验研究院 河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050091）

近年来，由于塑料制品普遍应用于食品包装、玩具、化妆品和医疗等很多材料中，邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）大量进入水体、土壤和生物体中，已成为全球最普遍的有机污染物之一。PAEs是一种常用的增塑剂和软化剂，可增大产品的柔韧性、可塑性和耐用性，广泛用于生产和生活用品中。PAEs会迁移出包装并污染与之接触的食品进而进入人体，存在很多风险和安全隐患。PAEs在人体内的残留将严重地影响到人类的生殖系统、免疫系统和神经系统，使生物体内激素不能正常分泌，肝肾功能下降，导致细胞突变、致畸和致癌等危害[1-3]。目前全球已有很多国家通过立法限制使用PAEs，包括欧盟《关于化学品注册、评估、许可和限制的法规》和美国《消费品安全改进法》等。我国卫生部在2011年6月发布的紧急公告中已将PAEs类物质列入食品中易滥用的非食用物质和违法添加剂名单。PAEs具有亲脂性，在原料引入、加工生产、包装贮运和销售等过程中极易从包装材料中迁移，当接触到水、油脂等物质时极易溶出，从而扩散到环境或食物中[4-5]。我国市场上绝大多数食用植物油采用塑料桶包装，PAEs很容易溶解迁移到植物油中，这也是PAEs超标的重要成因，已有相关文献报道食用植物油中PAEs的超标率达20.8%[6]，因此建立能同时检测多种PAEs残留的高通量筛查方法显得尤为重要。

植物油中脂肪类化合物容易和目标物PAEs共萃取，从而影响PAEs的准确定性定量分析。植物油中PAEs常用的前处理方法是固相萃取[7-9]和凝胶渗透色谱[10-11]提取。但这两种方法存在耗时长、操作繁琐和有机溶剂使用量大等不足，无法实现植物油中PAEs高效快速的检测。分散固相萃取技术的原理与固相萃取类似，但其具备溶剂消耗量更少、选择性更强、净化效果更好等特点[12-13]。目前检测方法主要是气相色谱法[14]、高效液相色谱法[15-16]、气相色谱-质谱联用法[17-21]和液相色谱-质谱联用法等[22-24]。由于植物油基质复杂、干扰性大，用普通质谱分析存在局限性，易出现假阳性造成误判。气相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱（gas chromatography-electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry，Orbitrap GCMS）具有高分辨率和高灵敏度的特点，同时测定化合物不受数量限制，可采集更为全面的化合物信息，能对复杂基质的低含量水平目标化合物进行快速准确筛查和定量分析。高分辨率可更好地分离目标化合物和干扰杂质；高质量精度可提供可靠、准确的数据；高灵敏度则保证了低浓度化合物的有效检出。因此，面对化学结构和性质非常相似，具有相同碎片离子且基质复杂的17 种PAEs，对其进行痕量分析，选择Orbitrap GC-MS方法显得更为稳定、方便、可靠。目前Orbitrap GC-MS技术已经用于制药研究[25]、环境分析[26]和水果蔬菜农药残留[27]中，而采用Orbitrap GC-MS测定植物油中PAEs研究鲜见报道。

本研究以植物食用油中17 种常见的PAEs为检测目标，采用乙腈提取，冷冻除脂和分散固相萃取净化，结合Orbitrap GC-MS技术，通过全扫描得到化合物的精确质量数，结合保留时间，建立了一种快速、准确地测定植物油中PAEs类塑化剂的方法，大大地提高了复杂背景下的抗干扰能力，使检测结果更加准确可靠，同时对实际样品进行验证取得了满意的结果。该方法具有检测速度快、通量高、结果准确可靠的特点，为国家监管提供了科学依据和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用大豆油、花生油、橄榄油、菜籽油、芝麻油、葵花籽油样品共6 类均购于当地超市，常温密封保存，备用。

乙腈、二氯甲烷、正己烷（均为色谱纯） 德国Merck公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷键合硅胶（ostadecylsilane，C18）、石墨化碳（graphitized carbon black，GCB） 美国Agilent公司。

17 种标准品（质量浓度均为1 000 μg/mL的混合标准溶液）：邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸二烯丙酯（diallyl phthalate，DAP）、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，DIBP）、邻苯二甲酸二正丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯（dimethylglycol phthalate，DMEP）、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯（bis(4-methyl-2-pentyl)phthalate，BMPP）、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯（bis(2-ethoxyethyl) phthalate，DEEP）、邻苯二甲酸二戊酯（dipentyl phthalate，DPP）、邻苯二甲酸二己酯（di-n-hexyl phthalate，DHXP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（butyl benzyl phthalate，BBP）、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯（bis(2-butoxyethyl)phthalate，DBEP）、邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexyl phthalate，DCHP）、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯（bis(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP）、邻苯二甲酸二苯酯（diphenyl phthalate，DPhP）、邻苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DNOP）、邻苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DNP）德国Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

Thermo ScientificTMGC-Orbitrap质谱仪 美国Thermo公司；DB-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；3K15型高速冷冻离心机德国Sigma公司；涡旋混合器 德国IKA公司；冰箱中国青岛海尔股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

Agilent HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度：260 ℃；程序升温：初始温度60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升温至220 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升温至280 ℃，保持10 min；载气：氮气（纯度≥99.999%），流速：1.0 mL/min；进样方式：不分流进样，进样体积：1 μL。

1.3.2 质谱条件

电离方式：电子电离源；电子能量：70 eV；离子源温度：280 ℃；传输线温度：300 ℃；采集模式：全扫描；质量分辨率：60 000 FWHM（m/z200）；扫描范围：m/z50～550；赛默飞TraceFinder工作软件。

1.3.3 标准溶液的配制

用玻璃移液管取混合标准溶液1 mL于100 mL棕色容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，配制成10 mg/L的标准混合工作溶液。将标准混合工作液用正己烷溶液稀释至质量浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L的标准系列溶液，于4 ℃冰箱中保存，待用。

1.3.4 样品前处理方法

1.3.4.1 试样处理

准确称取植物油试样2.0 g（精确至0.000 1 g）于15 mL具塞玻璃离心管中，准确加入2 mL乙腈，涡旋2 min，4 000 r/min离心3 min。重复提取3 次，合并3 次提取的上清液，将提取液置于-20 ℃冰箱中冷冻30 min。取1 mL提取液至预先加入100 mg C18粉、100 mg PSA粉的玻璃净化管中，涡旋1 min，4 000 r/min离心3 min。用微量玻璃注射器取上清液至进样品小瓶中，进Orbitrap GC-MS分析。

1.3.4.2 空白实验

除不加试样外，均按1.3.4.1节测定步骤进行。样品检测过程中不可避免引入PAEs，因此需对实验过程PAEs空白值进行控制和评价。整个处理过程均需在玻璃器皿中进行，试剂均采用色谱纯，避免塑料制品，防止检测过程中PAEs的混入，从而使检测结果更加准确。

1.3.5 数据库的建立

在优化色谱条件下进样，对17 种PAEs化合物进行一级质谱全扫描，获得相应化合物的离子信息。数据导入TraceFinder软件中，建立17 种PAEs化合物的一级精确质量数数据库，见表1。

表 1 17 种PAEs的分子式、保留时间、质谱信息Table 1 Molecular formulae, retention times and mass spectrometric parameters of the 17 PAEs

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

邻苯二甲酸酯类化合物难溶于水，但溶于大多有机溶剂。按照1.3.4节方法，本研究采用二氯甲烷、正己烷、乙腈、正己烷+乙腈进行提取，比较不同提取溶剂对17 种PAEs回收率（添加量1.0 mg/kg）的影响。结果表明，二氯甲烷提取效果较差，回收率最低；脂肪在正己烷中溶解度大，干扰严重；因为乙腈能够沉降蛋白，具有较好的除脂效果，同时脂肪在乙腈中溶解度低，但仍会有甘油三酯、甘油二酯、脂肪酸等也可以从植物油中同时萃取，给后续净化造成影响。用乙腈后再用正己烷萃取乙腈相中的脂肪，发现PAEs在正己烷中的溶解度增加随着PAEs碳链的增加而增加，导致如DEHP等回收率低，长碳链PAEs的损失更严重。因此对于植物油试样，仅用乙腈提取，而后上清液在-20 ℃冷冻30 min，油脂析出，再取上清液净化能有效地避免油脂对样品的干扰，并且样品中17 种PAEs的加标回收率均高于80%。

2.2 净化条件的选择

植物油样品中含有脂肪、多酚化合物和色素等复杂基质，若不净化将严重干扰测定，同时随着进样次数的增加，色谱峰会拖尾且仪器灵敏度会下降，干扰PAEs的测定，因此选择合适的净化方式对结果影响显著。本实验通过食用植物油中添加PAEs（1.0 mg/kg）进行加标回收，对C18、GCB和PSA三种净化剂进行比较。GCB对色素有很好的吸附作用，但同时对PAEs均有一定程度的吸附。C18是一种反向色谱净化剂，疏水性极强，能够有效吸附脂肪、脂肪酸和色素等化合物。PSA固相材料作为常用的分散固相萃取净化剂，可通过弱阴离子交换或极性作用去除植物油中的脂肪酸、有机酸和极性色素等物质。通过对不同比例的C18和PSA进行优化，发现当PSA和C18的用量均在150 mg时能取得较好的净化效果，基线明显较低并且基质的干扰被有效去除，同时PAEs的回收率在80%～110%之间，因此最终选择净化剂为150 mg PSA和150 mg C18。

2.3 本方法与国标方法样品前处理的比较

GB 5009.271—2016《食品中邻苯二甲酸酯的测定》方法是SPE净化-气相色谱-质谱联用[28]，国标法中样品用乙腈提取，超声提取，过SPE净化柱，氮吹后用正己烷定容上机。实验过程需要活化SPE净化柱，试剂用量多，操作复杂耗时长，同时过程中容易带入PAEs造成污染影响结果。本实验的测定方法是分散固相萃取净化和Orbitrap GC-MS联用，采用乙腈涡旋提取，冷冻除脂，分散固相萃取净化，取上清液上机。本方法分散固相萃取净化缩短了前处理的时间，Orbitrap GC-MS准确定性定量达到高通量检测的目的，其抗基质干扰的能力比单四极杆高，能够准确对PAEs定性定量分析，适用于植物油中PAEs快速筛查分析。

2.4 质谱条件的优化

Orbitrap GC-MS高分辨质谱与三重四极杆的定量手段不同，本研究采用的Orbitrap GC-MS是在全扫描模式下进行质谱全扫描，简化了气相色谱-质谱参数的优化，节省了样品前处理准备时间，方便快速开展筛查和准确定量分析，提高了工作效率和准确度。通过全扫描获得目标化合物的精确质量数，表1中列出17 种PAEs的3 个碎片离子的精确质量m/z，能够精确到小数点后4 位，能够有效准确与干扰物质区分。采用一个作为定量离子，另两个作为定性离子。研究发现，当样品检测中采用分辨率R=60 000及以上，基质干扰显著降低，筛查准确度提高，所有待测物目标物可以与基质中的干扰物明显区分，并可以对PAEs快速判断和准确定量，提高检测结果的可靠性。图1为17 种PAEs的总离子流色谱图。

图 1 17 种PAEs的总离子流色谱图Fig. 1 Total ion current chromatograms of the 17 PAEs

2.5 方法学验证

2.5.1 方法的线性范围、检出限和定量限

表 2 17 种PAEs的线性方程、相关系数r、线性范围、方法检出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges,LODs and LOQs of the 17 PAEs

采用Orbitrap GC-MS对17 种PAEs进行定性定量分析，用正己烷将混合标准贮备液逐级稀释，配制一系列的混合标准工作液，以色谱峰面积（Y）为纵坐标，相应溶液的质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线。在空白基质中添加标准溶液，以分析物响应约为3 倍噪声和10 倍噪声时确定方法的检出限和定量限。结果表明，17 种PAEs在相应质量浓度范围内呈良好的线性关系（R2＞0.995 0），检出限在0.005～0.010 mg/kg范围内，定量限在0.015～0.030 mg/kg范围内，可满足检测要求（表2）。

2.5.2 回收率和精密度

本实验选取大豆油、花生油、橄榄油和菜籽油4 种具有代表性的植物油样品进行加标测定实验，考察该方法的精密度和回收率。按照1.3.4节的前处理方法，对样品分别添加高、中、低水平分别为0.03、0.20、0.50 mg/kg的17 种PAEs混合标准溶液，在优化的条件下进行测定，每个添加水平重复测定6 次，计算其平均回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。平均回收率为除了DPhP回收率范围在80.2%～84.2%略偏低以外，其他在85.1%～109.5%之间，RSD为1.2%～9.8%。说明该方法具有较好的回收率和重复性，可以满足植物油试样中17 种PAEs日常监测的要求，数据准确可靠。

表 3 大豆油、花生油、橄榄油和菜籽油4 种基质3 个添加水平17 种PAEs的加标回收率和RSD（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of the 17 PAEs from soybean oil, peanut oil, olive oil and rapeseed oil samples at three spiked levels (n= 6)

续表3

2.6 实际样品的测定结果

采用本实验建立方法对50 个批次的植物油样品（包括大豆油、花生油、橄榄油、菜籽油、芝麻油和葵花籽油）中的17 种PAEs残留量进行测定。结果显示：DIBP在10 个批次中有检出，含量范围在0.042～0.317 mg/kg之间；DBP在30 个批次的样品中均有检出，含量范围在0.059～0.934 mg/kg之间；DCHP在15 个批次的样品中均有检出，含量范围在0.038～0.417 mg/kg之间，DEHP在30 个批次的样品中均有检出，含量范围在0.032～0.817 mg/kg之间，其他邻苯二甲酸酯类在所有样品中未检出，其中菜籽油和大豆油中PAEs残留量较多，分析其中原因主要是在生产工艺和运输过程中不合格容器和包装材料的使用导致PAEs容易迁移到植物油中。随后对阳性样品采用GB 5009.271—2016《食品中邻苯二甲酸酯的测定》方法测定，该方法中DIBP、DCHP和DEHP的定量限为0.5 mg/kg，DBP定量限为0.3 mg/kg，PAEs测定值低于定量限时无法准确测定。本实验所建立的方法具有更低的定量限，能够测定低水平的PAEs，同时速度快、定性定量更准确，完全满足实际样品筛查的需求。图2为大豆油基质阳性样品总离子流图，可以看出样品基质复杂，从图中难以判断所检出化合物，图3为标准品和大豆油阳性样品DBP和DEHP的质谱图。

图 2 大豆油阳性样品中PAEs的总离子流色谱图Fig. 2 Total ion current chromatograms of PAEs in positive soybean oil sample

图 3 标准品和大豆油阳性样品DBP和DEHP的质谱图Fig. 3 Mass spectra of reference materials and positive soybean oil sample

3 结 论

本实验建立分散固相萃取净化结合Orbitrap GC-MS分析植物油中17 种PAEs的方法。方法采用分散固相萃取净化，不需经过固相萃取和凝胶色谱净化等繁琐步骤，节约成本和时间，通过保留时间和精确质量数据库筛查对目标化合物进行准确定性，采用外标校准曲线法定量，实现植物油中17 种PAEs的筛查、确证与定量，并得到了满意的结果。本方法除基质干扰的能力和净化效果好，去除假阳性的干扰，准确度和精密度高，适合于植物油中17 种PAEs的同时快速检测，为植物油样品中痕量PAEs的测定提供了重要技术手段。