基于网络药理学与分子对接的连夏消痞颗粒治疗功能性消化不良机制分析

孙彩虹，李瑞明，田 野，黄爱岚，刘 杨，何 毅*

（1.中国药科大学中药学院，江苏 211198；2.天士力控股集团有限公司研究院现代中药开发中心，天津 300410；3.天士力医药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410；4.天士力控股集团有限公司研究院化学药品开发中心，天津 300410）

功能性消化不良（FD）是指具有上腹痛、上腹胀、早饱等不适症状的非器质性疾病，是常见的功能性胃肠疾病［1］，本病全球范围内患病率高达10%～30%［2］。连夏消痞颗粒由经典验方半夏泻心汤化裁而来，其具有和胃降逆、开结消痞的功效。临床研究结果表明，连夏消痞颗粒对FD 具有显著的治疗作用。本课题组前期研究鉴定出100 个化学成分，主要为黄酮苷、生物碱类、香豆素类化合物（未报道数据）。但连夏消痞颗粒治疗FD 的相应的机制尚未明确，需要进一步研究。

网络药理学的概念由Andrew L Hopkins 于2007年首次提出，是基于多药物-多靶标-多疾病形成的相互作用网络分析药物与疾病的治疗作用［3］。分子对接（molecular docking）是基于受体结构的药物设计及筛选方法寻找小分子（配体）与生物大分子（受体）之间最佳结合构象［4］。本研究在前期物质基础研究的基础上，采用网络药理学与分子对接对连夏消痞颗粒治疗FD的潜在通路、靶点和活性成分进行预测，以期为连夏消痞颗粒治疗FD 的作用机制研究提供理论参考。

1 方法

1.1 活性化合物筛选及其靶点的检索 结合本实验室前期研究基础采用PubChem 数据库获得已鉴定全方化学成分详细信息，利用TCMSP 数据库对全方化学成分进行活性筛选（口服利用度≥30%，类药性≥0.18），并结合STITCH 数据库对活性化合物靶点进行检索去重，最后利用UniProt 数据库进行基因名统一。

1.2 FD 相关作用靶点的检索 通过在OMIM 数据库、GeneCard 数据库和DigSee 等数据库中输入“functional dyspepsia”、“abdominal pain”、“Postprandial Discomfort Syndrome”、“epigastric pain syndrome”等关键词搜索FD 相关作用靶点，去除重复靶点并结合文献进行筛选，最终获得FD 相关作用靶点。

1.3 活性化合物-靶点网络的构建 将获得的活性化合物作用靶点和FD 作用靶点取交集得到活性化合物与疾病共同作用靶点。利用Cytoscape 3.7.2 软件构建药味-活性化合物-共有靶点网络图。该网络图中采用不同颜色代表不同节点类型，具有相互作用的节点以边相连。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建与分析 将上述共有靶点导入STRING11.0数据库，限定物种为homosapiens，设置minimum required interaction score 为medium confidence（0.400），导出PPI 网络TSV 格式文件。将该TSV 文件导入Cytoscape 3.7.2 软件进行网络分析。

1.5 靶点GO 富集 将上述化合物和疾病共有作用核心靶点导入DAVID 6.8 数据库，利用其functional annotation功能，输入official gene symbol，设定background 为人源，进行GO 富集分析。

1.6 KEGG 富集通路分析 将上述化合物和疾病共有作用核心靶点导入KOBAS 3.0 数据库，利用其Gene-list Enrichment 功能，输入gene symbol，设定background 为人源，进行KEGG 通路富集分析，并构建活性化合物-靶点-信号通路网络图。

1.7 分子对接 将上述得到的核心靶点与小分子化合物进行分子对接。在ZINC 数据库下载mol2 格式文件，在PDB 数据库下载蛋白分子晶体结构。采用DOCK 6.0 进行分子对接。首先准备受体文件，包括删除配体、去除溶剂、加氢和加电荷等，将受体保存为mol2 格式，之后受体去氢另存为pdb 文件。准备配体文件，给配体加氢和合适的电荷。选择晶体结构中配体所在的位置作为结合位点，距离该位点一定半径内的球集为活性口袋。在活性口袋外生成盒子，除指定文件路径外，其余参数采用默认值。

分子对接时采用grid score 评价小分子化合物与蛋白靶点的亲和力大小，得到对接打分值以及小分子的结合构象及两者间的相互作用情况。用Pymol 软件对对接结果进行可视化分析。

2 结果

2.1 活性化合物及其作用靶点信息 通过数据库的检索与筛选，得到活性化合物27 个，其中黄连有6 个活性化合物，包括小檗碱、黄连碱、巴马汀等，黄芩有14 个活性化合物，包括黄芩素、汉黄芩素等。各药味化合物详细信息见表1。在TCMSP 数据库和STITCH 数据库中检索到各个活性化合物的作用靶点统计信息见表2，去重后共得到作用靶点193 个。

2.2 药味-活性成分-靶点网络分析 取交集得到82 个共有靶点，如图1 所示。将共有靶点导入STRING 数据库，随后用Cytoscape 3.7.2 软件构建药味-活性化合物-靶点网络图，结果如图2 所示。该网络图中共有114 个节点（nodes），277 条边（edges）。表3 列出了部分节点及介度（betweenness centrality）与紧密度（closeness centrality）［5，6］的拓扑学结构数据。

该网络中菱形节点代表药味节点，有7 个；矩形节点代表活性化合物节点，有25 个，因5，8，2′-三羟基-7-甲氧基黄酮和枸橘苷未搜索到其作用靶点，故未显示；椭圆形节点代表靶点节点，有82 个。其中，连夏消痞颗粒方中的黄连和黄芩的度值最高。

该网络中degree 值高的靶点有PTGS2、PTGS1、NOS2、SCN5A、PIK3CG、RXRA、CASP3、ADRB2、KCNH2、NOS3 等，其中PTGS2 与23 个化合物有相互作用，PTGS1与18 个化合物有相互作用；黄芩中的汉黄芩素（MOL000173）与26 个靶点蛋白形成相互作用。这符合中药复方多成分-多靶点协同作用的特点。

表1 连夏消痞颗粒活性化合物信息

表2 连夏消痞颗粒活性化合物对应靶点信息

图1 连夏消痞颗粒治疗FD 靶点韦恩图

图2 药味-活性成分-靶点网络图

表3 药味-化合物-靶点网络的关键节点及其拓扑学性质

2.3 PPI 网络分析 PPI 网络结果如图3 所示，共有81 个节点（CA2 未与其他蛋白相互作用，本图并未显示）和949 条边，平均每个节点的度值为23.43。根据大于度值的二倍中位数（42）对蛋白靶标进行筛选得到AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、FOS、TNF、CASP3、TP53、JUN、PTGS2 核心靶点，核心靶点详细信息如表4。

图3 连夏消痞颗粒与FD 交集靶点的PPI 网络

表4 PPI 网络中的关键节点信息

2.4 核心靶点GO 功能富集 利用DAVID 6.8 数据库的functional annotation 功能对上述核心靶点进行了GO 富集分析，得到生物过程（Biological Process）、分子功 能（Molecular Function） 和 细 胞 组 成（Cellular Components）共106 条GO 条目（P＜0.05）。其中生物过程相关条目88 条，包括一氧化氮生物合成过程、ERK1和ERK2 级联，对糖皮质激素脂多糖、抗生素等的反应，炎症反应，凋亡过程、细胞增殖的负调控等生物功能。分子功能相关条目13 条，包括转录调控区DNA 结合、酶结合、蛋白酶结合、蛋白质异二聚体活性、细胞因子活性、转录因子结合等。细胞组成相关条目5 条，包括细胞质、细胞核、细胞核质、内质网、蛋白质复合物及转录因子复合体等。生物过程与分子功能各选取前10条、细胞组成选取前5 条作图如图4 所示。

图4 连夏消痞颗粒治疗FD 核心靶点生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC）富集分析

2.5 核心靶点KEGG 通路富集分析 利用KOBAS 3.0 在线工具对Pathway 富集分析中得到167 条信号通路（P＜0.05），选取前20 条绘制如图5，包括TNF、IL-17、MAPK、Toll 样受体、T 细胞受体、VEGF、PI3K-Akt、HIF-1 等信号通路。此外，还涉及到病毒感染通路和传染性疾病通路。可分析出连夏消痞颗粒可能通过TNF 信号通路、IL-17 信号通路、Toll 样受体信号通路治疗FD。

2.6 活性化学成分-靶点-信号通路网络图构建 为进一步直观研究连夏消痞颗粒治疗FD 是通过哪些信号通路起作用，选取排名前五的信号通路构建活性化合物-核心靶点-通路网络，结果如图6 所示。根据节点大小可以看出PTGS2、AKT1、IL6、MAPK3、TNF、CASP3 等靶点与化合物和通路均有较强的相互作用关系，与“2.3”项下所得出的结果一致。小檗碱、巴马汀、黄芩素、汉黄芩素、β-谷甾醇及部分其他化合物是该网络的关键节点。

图5 连夏消痞颗粒治疗FD 核心靶点的KEGG 通路分析

2.7 分子对接 将小分子与核心靶点对接，根据靶点与原配体的结合位点确定对接位置。打分值为负值，说明小分子与蛋白存在相互作用；打分值越低，说明两者相互作用力越强。IL-6 受体抑制剂大多为单抗，原癌基因蛋白c-Fos（FOS）解析的晶体结构中无配体结合，故将不对其深入分析；分析过程中发现β-谷甾醇分子结构复杂，无法与各个靶点对接，故表中未显示。最终确定基因AKT1、MAPK3、VEGFA、TNF、CASP3、TP53、JUN、PTGS2 编码的PDB ID 分别为4GV1、4QTB、6GQO、2AZ5、3KJF、5G4N、5AEP、3MQE。小分子与靶点对接结果如表5 所示。可看出打分值均为负值，说明活性物质均可对接到活性口袋中。柚皮素、木蝴蝶素A 与其中7 个靶点有较好的结合力；黄芩素、汉黄芩素与其中6 个靶点可以结合；小檗碱与PTGS2、TNF、VEGFA3个靶点结合能力强。

图6 活性成分-靶点-通路网络图

表5 关键靶点与活性化合物打分值

前期物质基础研究发现，小檗碱和黄芩苷是连夏消痞颗粒的主要成分，黄芩苷在体内可代谢为黄芩素。图7、图8 分别展示了小檗碱和黄芩素与VEGFA（综合打分值最低）结合情况，可直观观察小分子与氨基酸残基相互作用。

由图7 可看出小檗碱占据了VEGFA 的活性空腔，与 GLY922、GLU917、LYS868 形成范德华力，与LEU1035、PHE918、VAL899 等氨基酸残基形成π 键作用。黄芩素与其中6 个靶点均能较好结合，主要作用力为氢键、范德华力及π 键作用。由图8 可看出，黄芩素很好的占据了VEGFA 的活性空腔，可与其中的CYS919 等残基形成氢键作用，与GLY922、ALA1050、GLU885 等残基形成范德华力，与LEU1035、PHE918 等残基形成π 键作用，有较强的相互作用。

图7 小檗碱与VEGFA 最优结合模式

3 讨论

本研究通过网络药理学和分子对接技术，对连夏消痞颗粒活性成分筛选、靶点预测和网络分析，发现活性化合物27 个，潜在靶点193 个，与FD 共有靶点82 个，筛选出核心靶点10 个，分子对接结果表明小檗碱、黄芩素、柚皮素、木蝴蝶素A、汉黄芩素可能与PTGS2、TNF、MAPK3、JUN 等靶点相互作用来治疗FD，GO 富集分析条目130 条，KEGG 信号通路167 条，说明连夏消痞颗粒治疗FD 具有多成分-多靶点-多通路的特点。

图8 黄芩素与VEGFA 最优结合模式

GO 富集中生物过程主要涉及到炎症反应、细胞凋亡、代谢过程、药物反应、体液免疫应答等方面。KEGG 富集结果显示其作用通路可能是TNF 信号通路、IL-17 信号通路、Toll 样受体信号通路、MAPK 信号通路等。

PPI 网络分析结果显示，连夏消痞颗粒的活性成分主要通过作用于AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、FOS、TNF、CASP3、TP53、JUN、PTGS2 等靶点发挥治疗FD的作用。网络药理学结果表明连夏消痞颗粒治疗FD可能的主要活性成分共8 个，分别为β-谷甾醇、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、木蝴蝶素A、木兰花碱、小檗碱、巴马汀。

分子对接结果显示小檗碱与VEGFA、PTGS2、TNF有较好的结合活性，小檗碱可能通过作用于以上3 个靶点调节TNF 信号通路与IL-17 信号通路来治疗FD，有研究表明小檗碱在胃肠道疾病（溃疡性结肠炎）中通过抗炎发挥治疗作用，对炎性因子的表达有直接抑制作用［7］，并且对情绪障碍也有一定的调节作用［8］。此外，黄芩素与VEGFA、MAPK3、PTGS2、TNF、JUN、TP53 等靶点结合力强，分子对接结果表明黄芩素可能通过作用于以上靶点调节TNF 信号通路、IL-17 信号通路与Toll 样受体信号通路发挥治疗FD 作用。前期研究基础表明黄芩苷在连夏消痞颗粒中大量存在。有研究报道黄芩素在体内和体外均能发挥抗炎作用，可能是通过NF-κB 信号通路的多步抑制来发挥作用［9，10］。精神心理因素是导致FD 的机制之一，研究表明黄芩素可在不依赖5-羟色胺系统的情况下起到抗焦虑及镇静作用［11］，还有研究表明黄芩素可以减轻幽门螺旋杆菌感染［12］。此外，连夏消痞颗粒以黄芩苷和盐酸小檗碱双指标成分含量作为质量控制指标［13，14］，因此，在后续试验中，可对小檗碱和黄芩素通过作用于MAPK3、PTGS2、TNF、JUN 等靶点调节TNF 信号通路、IL-17 信号通路与Toll 样受体信号通路方面进行深入研究。

综上所述，本研究利用网络药理学与分子对接技术对连夏消痞颗粒的主要活性成分及其治疗FD 的作用机制进行了初步的筛选和分析，为后续深入研究连夏消痞颗粒发挥药效作用的物质基础及作用机制提供了方向，也为连夏消痞颗粒质量标准提升中指标成分的选择提供了一定的理论依据。