芒柄花素对脑缺血再灌注后血脑屏障完整性影响

孙 瑜 ，刘 淼*，王 健，陈 磊，乔 夕，陈莉莉，韩真真，孙精通

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津市儿童医院，天津 300074）

血脑屏障（BBB）是血-脑、血-脑脊液和脑脊液-脑三种屏障的总称，是脑毛细血管阻止某些物质由血液进入脑组织的结构。脑缺血再灌注后，BBB 的一些微细结构发生变化，使其开放性具有一定规律［1-5］。近年来，大量研究表明［8-10］芒柄花素（FMN）在抗肿瘤、降血脂、改善雌激素水平等方面有显著效果，在脑缺血再灌注（I/R）损伤中具有抑制神经炎症、保护BBB 的作用。芒柄花素引入磺酸基，制成芒柄花素磺酸钠（Sul-F），具有很好的水溶性。本研究拟进一步考查Sul-F 注射液对大鼠脑缺血再灌注后BBB 完整性的影响，以期进一步为其临床用药提供一定实验数据。

1 材料与仪器

1.1 材料 SPF 级SD 大鼠，雄性，初始体重（250±20）g，生产许可证号:SCXK-（军）2014-0001，购于中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，饲养室温度20～25 ℃、相对湿度50%～65%。Sul-F 对照品（河北国金药业有限责任公司，批号09092602，纯度95%以上）；Sul-F（山东绿叶天然药物研究开发有限公司，规格：5 ml∶100 mg，批号09092602）。Evans Blue（Solarbio，规格:1 g，批号619C049）；甲酰胺（分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号20150819）；氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司，批号A15012304-2）；水合氯醛（分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司，批号20020323）。

1.2 仪器 激光多普勒及经皮氧分压测量仪PeriFlux System 5000 (Datavagen 9A，175 43 Jarfalla，Sweden)；STRONG 90 牙科钻（SAESHIN PRECISION IND.CO.）；INFINITE 200 PRO 酶标仪（Tecan Austria GmbH）；SIGMA 3K15 低温高速离心机（北京五洲东方科技发展有限公司）；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；T 18D S25 组织匀浆机（IKA，Germany）；FA1004 上皿电子天平（中华人民共和国上海精科天平）。

2 方法与结果

2.1 BBB 通透性检测 大鼠称重后于手套内，处于清醒状态，于相应时间点前0.5 h 尾静脉注射2%EB（注射量：4.0 ml/kg，Sul-F 给药量为20 mg/kg。2%EB 由注射用水稀释4 倍的Sul-F 注射液配制）。0.5 h 后，10%水合氯醛麻醉大鼠，开胸用生理盐水左心室灌注，直至右心耳流出液为清亮。取脑，生理盐水冲洗干净，纱布擦干，称其湿重后放入试管中，加入甲酰胺至6 ml（约为脑重量的3 倍），盖上盖子45 ℃水浴24 h，冰浴中匀浆。取出后4 ℃、15 000 r/min 离心20 min，取上清液，于酶标仪620 nm 测吸光度，根据所测得的吸光度在绘制的标准曲线上查得EB 浓度。

2.2 脑缺血再灌注动物模型（MCAO）的制备及评价 采用线栓法制备大鼠MCAO 模型。用栓线阻断大鼠大脑中动脉，并于缺血60 min 后行再灌注。假手术组只分离、暴露血管，不结扎颈总动脉及颈外动脉，不插入栓线。采用多普勒激光血流仪（laserdoppler flowmetry，LDF）监测大鼠大脑中动脉栓塞及再灌注后的脑血流(cerebral blood flow，CBF）动态变化［6，7］。

2.3 实验动物分组 取SD 大鼠禁食不禁水12 h，复制大鼠脑缺血再灌注模型，随机分为假手术组（n=5）、溶剂对照组（n=5）、给药组（n=5）。分别于脑缺血1 h 及再灌注0、1、4、24 和48 h 实施心脏灌流后取脑组织进行匀浆（每组分别于取样前0.5 h 按20 mg/kg 剂量尾静脉注射Sul-F 注射液），按脑组织样品预处理方法处理，使用酶标仪于620 nm 下测定EB 吸光度。

2.4 标准曲线 称取适量伊文思兰加入空白脑匀浆液使其浓度依次为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 和80 μg/ml。置于45 ℃水浴箱24 h，以甲酰胺作为空白对照管，用荧光酶标仪在EB 最大吸收光谱620 nm 处测定各浓度（C 值）EB 溶液的吸光度（Y 值），根据所测数值计算出回归方程。结果EB 在0.625～80 μg/ml 浓度范围内线性关系良好，其回归方程为Y=0.020 9C-0.001 2（n=8，r=0.999 8）。

2.5 Sul-F 对BBB 完整性影响 复制大鼠脑缺血再灌注模型，按实验动物组别分别尾静脉注射2%EB、Sul-F 注射液（以2%EB 配制）。分别测得脑缺血1 h 及再灌注0、1、4、24 和48 h 伊文思兰浓度-时间数据见表1，浓度－时间曲线见图1，BBB 透过率的比较见图2。

表1 模型大鼠溶剂组/给药组伊文思兰浓度-时间数据（，n=5）

与溶剂组比较，*P＜0.05

图2 血脑屏障透过率比较图

3 讨论

3.1 脑组织中EB 的提取 考查了甲酰胺、三氯乙酸提取脑组织中的EB。以甲酰胺为提取剂提取脑组织中的EB，可以对整个脑组织进行提取，而不必匀浆，大大避免了样品损失，实验结果显示线性关系良好。

3.2 Sul-F 对BBB 完整性的影响 伊文思兰实验表明Sul-F 具有降低脑缺血再灌注损伤中BBB 完整性的作用。根据相关研究表明［8］，芒柄花素能显著减少炎症因子iNOS、TNF-α 和IL-1β 的表达，降低BBB 通透性和MMPs 活性，改善神经功能损伤。本实验研究结果显示，Sul-F 能一定程度上降低脑缺血再灌注模型大鼠BBB 伊文思兰透过率。

脑缺血再灌注损伤后BBB 完整性受到一定破坏，并且呈开放、关闭波动式变化：脑缺血1 h 及再灌注0、4 和48 h 时，BBB 透过率相对较高，脑缺血1 h 及再灌注1 和24 h 时，BBB 透过率相对较低；且脑缺血1 h 及再灌注4 h 时，BBB 透过率最高。

相应时间点，给药组比溶剂组EB 的透过率低7.0～9.0 μg/ml，提示在不同时间点给予Sul-F 后，均呈现明显的降低BBB 通透性的作用，表明Sul-F 能一定程度上降低脑缺血再灌注模型大鼠BBB 伊文思兰透过率。