PD-1 抗体联合CXCL10 对肝癌的抑制作用及其机制研究

杨圆圆，林芳珍，范冬梅，杨 铭*

（1.天津医科大学总医院，天津 300020；2.中国医学科学院血液病医院，中国医学科学院血液学研究所，天津 300020）

肝癌是世界第五大常见恶性肿瘤，在我国位列第二，近年来肝癌的发病率也呈逐年上升趋势［1］。至今，手术仍然是肝癌治疗的首选，但仅有少数患者适合手术切除［2］。对于失去手术机会和复发的肝癌患者，寻找药物治疗的新方法、新途径仍是研究热点。近年来肿瘤免疫治疗的新策略和新思路得到广泛的研究和发展，并为传统治疗注入新的活力。其中又以PD-1/PD-L1通路抑制剂在实体瘤中的治疗效果最为显著，目前已应用于黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤。有文献总结了免疫治疗药物发挥作用的三个要素［3］，即肿瘤的突变负荷、肿瘤内部淋巴细胞的浸润情况以及PD-L1 的表达水平。CXCR3/CXCL10 趋化轴是T 细胞迁移的重要信号通路，CXCL10 可以招募多种免疫细胞直接杀伤肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用，提高患者总生存率。肿瘤部位CXCL10 的表达缺陷可能是造成肿瘤免疫逃逸的作用机制之一［4-6］。基于以上研究，笔者推测CXCL10 能够促进PD-1 抗体的抗肿瘤作用。本研究以腺病毒为载体使肿瘤细胞表达PD-1 抗体及趋化因子CXCL10，探讨其对HepG2 细胞的生长抑制作用及其机制，以期为肿瘤的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 BALB/c 裸鼠15 只（5～6 周龄，体重15～20 g，雌性），购自北京维通利华实验技术有限公司，饲养于实验血液学国家重点实验室SPF 级实验动物房，实验动物许可证号为：SYXK（津）2020-0003。动物实验方案遵循实验动物伦理的相关规定。

1.1.2 主要仪器设备 电泳仪（型号：200/2.0 型，BIORAD 公司），全自动凝胶成像系统（型号：Tanon1600，上海天能），恒温金属浴（型号：DKT200-2A，杭州米欧仪器有限公司），恒温CO2培养箱（Thermal Scientific），倒置显微镜（型号：CKX41，日本OLYMPUS），荧光/化学发光成像分析仪（型号：ImageQuant LAS-4010，GE 公司），Synergy H4 多功能酶标仪（型号：Synergy H4，Bio Tek公司），流式细胞分析仪（型号：FACSCantoII，BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝细胞癌细胞系HepG2、人胚肾细胞系293A 由本实验室保存。使用含10%FBS 及2 mM L-谷氨酰胺的DMEM 培养基，于37 ℃、5% CO2条件下培养。

1.2.2 腺病毒穿梭质粒的构建及病毒包装 包装腺病毒所使用的穿梭质粒为pAd-AFP-anti-PD-1-CXCL10，合成anti-PD-1 单链抗体及CXCL10 碱基序列。将穿梭质粒与pAdEasy-1 骨架质粒正确重组后，根据Adeasy 腺病毒包装手册说明于293A 细胞中包装腺病毒。转染10～14 d 后出现细胞病变效应，反复冻融病毒上清三次收集为第一代病毒。继续传两代收集第三代病毒，于-80 ℃保存。

1.2.3 Western blot 检测目的蛋白表达 取对数生长期的HepG2 及MCF-7 细胞，调整细胞密度为1.5×105/ml，接种于六孔板，待细胞沉于孔板底部后，按100 MOI 的感染复数分别加入腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10或对照病毒Ad-track，48 h 后采用Western Blot 方法检测蛋白表达。

1.2.4 ELISA 检测分泌蛋白的表达 根据CXCL10 ELISA 检测试剂盒（eBioscience）检测病毒感染后细胞上清，具体操作如下：取50 μl Standards 或样品加入酶标板中（每个样品设置复孔）。于所有复孔中分别加入50 μl 酶标抗体，室温封闭孵育30 min。260 μl Wash Solution 洗板4 次。每孔加入100 L TMB 底物液，室温孵育10～15 min。每孔中加入50 μl 终止液以终止酶反应，酶标仪测定450 nm 处吸光度。绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中CXCL10 的浓度。

1.2.5 检测活化T 细胞CD8 阳性群体中CXCR3 阳性率 取外周血单个核细胞（PBMC），调整细胞密度为2×106/ml，加入终浓度为0.5 μg/ml 的anti-CD3 及anti-CD28 抗体。于0、3、6 和9 d 收集细胞，流式细胞仪检测CD8 阳性细胞CXCR3 表达水平。

1.2.6 检测共培养后HepG2 细胞PD-L1 阳性率 取对数生长期的HepG2 细胞，调整细胞密度为1×105/ml，待细胞沉于板底部，以不同比例（2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1）加入活化后的T 细胞，72 h 后收集细胞，流式细胞仪检测HepG2 细胞表面PD-L1 表达水平。

1.2.7 Transwell 检测CXCL10 对T 细胞的趋化作用 取感染病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 后的HepG2 培养上清600 μl，并使用CXCL10 因子作为阳性对照（终浓度为10 ng/ml）。将Transwell 小室放入孔板中，于细胞培养箱预平衡1 h。期间，收集anti-CD3、anti-CD28抗体激活后的T 细胞1×106个置于上室。3 h 后，吸取300 μl 下室细胞，加入50 μl 计数Beads（123 count eBioscience），充分混匀后流式检测Beads 所占比例，并计算下室细胞数。

1.2.8 Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 对BALB/c 裸鼠HepG2 移植瘤生长抑制作用 选用BALB/c 裸鼠（雌性，5～6 周龄，体重16～18 g）建立人肝细胞癌HepG2细胞系移植瘤模型。接种前1 d，以300 cGy/只的剂量进行γ 射线照射。收集对数生长期的HepG2 细胞，于小鼠右前肢根部背侧皮下接种，每只接种200 μl HepG2细胞悬液（5×106/只）。待肿瘤生长至100～200 mm3时进行实验。每周两次瘤内注射浓缩后的腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10，并经尾静脉注射活化后的T细胞（5×106/只）。隔日记录肿瘤长宽，并计算体积。

2 结果

2.1 腺病毒表达载体的构建及蛋白的表达 如图1 A所示，构建腺病毒表达载体，经测序验证其正确性。Western blot 结果显示，感染腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10（DOUBLE）后，HepG2 中anti-PD-1，CXCL10均能正确表达。而MCF-7 细胞由于缺乏AFP 启动子活性不能表达目的蛋白（图1 B）。目的条带与相应内参灰度值之比见图1 C。ELISA 结果表明HepG2 培养上清中分泌的CXCL10 浓度约为（1.35±0.33）ng/ml（图1 D）。

2.2 CXCR3/CXCL10、PD-1/PD-L 通路在效靶细胞相互作用过程中激活 经anti-CD3、anti-CD8 抗体活化后CD 8 阳性T 细胞CXCR3 表达逐渐上调（图2 A），CXCL10 可通过与其受体结合募集活化T 细胞。HepG2与活化后T 细胞相互作用可使其PD-L1 表达上调，并且PD-L1 阳性比例随效靶比例增加而进一步升高，20∶1 时可达71.1%（图2 B）。过往的研究中已经证实T细胞激活后其PD-1 表达水平上调［7］，故PD-1/PD-L1通路可在效靶细胞相互作用过程中激活。

图1 腺病毒表达载体的构建及蛋白的表达

图2 CXCR3/CXCL10、PD-1/PD-L 通路在效靶细胞相互作用过程中激活

2.3 CXCL10 对活化T 细胞趋化作用 本研究采用Transwell 的方法在体外检测活化后的T 细胞的趋化性，使用流式细胞术对迁移到下室的细胞进行计数。结果显示，Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 组与阳性对照组（加入CXCL10 因子）不存在明显差异，而对T 细胞趋化效果明显强于对照组（Adtrack 感染组）（图3）。说明由感染病毒后的HepG2 细胞分泌的CXCL10 可有效募集活化T 细胞。

图3 CXCL10 可趋化活化T 细胞

2.4 腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 对BALB/c裸鼠HepG2 皮下移植瘤生长的抑制作用 浓缩腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10，50 μl/只瘤内给药治疗，并以PBS 作为对照组，同时经尾静脉给予活化的T细胞。HepG2 细胞移植瘤裸鼠接受治疗后，每3 d 测量一次肿瘤体积，动态观察肿瘤的生长状况。结果显示，尽管与PBS 组相比不具有显著差异，腺病毒Ad-AFPanti-PD-1-CXCL10 可一定程度减慢HepG2 肿瘤的生长，抑制率约为28.66 %，欠佳的治疗效果可能与病毒用量及注射的T 细胞数量相关。见图4。

图4 腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 对HepG2 皮下移植瘤的治疗作用

3 讨论

本研究联合PD-1 抗体与趋化因子治疗肝细胞癌，探讨了相关理论基础，证明了联合用药机制上的可行性，并对体内抑瘤效果进行了初步评价。结果表明，以腺病毒为载体，受甲胎蛋白基因（alpha-fetoprotein，AFP）启动子操控的目的蛋白可在肝癌细胞HepG2 中特异表达，而不表达于MCF-7 乳腺癌细胞。HepG2 分泌的CXCL10 可以有效趋化激活的T 细胞。初步体内试验表明该实验方案可以延缓肿瘤的生长速度。

PD-1/PD-L1 抗体是免疫治疗的新手段，但有相当部分患者对其不响应。目前开发多种形式的联合治疗方案，提高PD-1 抗体的治疗效果是研究热点。PD-1/PD-L1 抗体是以调动T 细胞活性为基础的抗肿瘤方法，研究表明肿瘤部位淋巴细胞的浸润，是影响其治疗效果的重要因素。笔者推测使肿瘤局部高表达恰当的趋化因子是增加淋巴细胞浸润的有效方式［6］。CXCL10/CXCR3 是CD8 阳性T 细胞迁移的信号轴，可募集激活状态的细胞毒性T 细胞。本研究中，笔者于体外证明了T 细胞激活后CXCR3 表达上调，并可被感染腺病毒的HepG2 分泌的CXCL10 有效募集。

在基因转移载体的选择上，腺病毒载体是目前在肿瘤治疗的临床试验中应用最多的载体，因其具有：宿主范围广，无致癌性，易于纯化和浓缩，载体容量大等优点。迄今，已知人腺病毒至少拥有近50 种血清型，大多数腺病毒载体都是基于血清型2 和血清型5。重组人Ad5 型腺病毒是我国唯一上市的病毒疗法，已批准用于肿瘤的辅助治疗，将其作为新冠病毒疫苗的临床试验也在开展当中。因此，在肿瘤的基因治疗中，目前应用较多的腺病毒载体仍是首选。

在体内实验中，可分泌PD-1 抗体及CXCL10 趋化因子的腺病毒并未产生预期的抑瘤效果。笔者推测有两方面原因，一是瘤内注射的给药方式限制了病毒的使用量，经多次预实验表明50 μl 为瘤内注射剂量的上限，病毒剂量的不足可直接导致治疗蛋白的分泌量不足。二是本实验采用免疫缺陷鼠，并单独给予活化的T 细胞，推测T 细胞能够在趋化因子的作用下向肿瘤组织聚集，同时PD-1 抗体能够阻断免疫抑制信号，增强T 细胞的杀伤作用。但单独给予的异种来源T 细胞与经过抗原提呈细胞活化的T 细胞有本质区别，不具备识别肿瘤抗原的能力，因而仅具有非特异杀伤作用。在后续实验中笔者将采用人源化小鼠来解决肿瘤细胞异种移植带来的免疫微环境缺失的问题。总之，本研究以腺病毒为载体，联合PD-1 抗体和趋化因子，为肿瘤免疫治疗提供了新的思路。