局部进展期直肠癌PARP-1表达与临床转归的关系

谢旭赟 钱莉文 刘海 孙晓南

术前放化疗联合全直肠系膜切除术是局部进展期直肠癌的标准治疗手段，虽然能降低肿瘤局部复发的风险[1-2]，但仍有22%的患者5年内发生局部复发或远处转移。早期识别局部进展期直肠癌患者的临床转归，有助于发现高危患者并采取积极的治疗措施，改善临床预后。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly（ADP-ribose）polymerase-1,PARP-1]是一类存在于多数真核细胞中具有重要生理功能的蛋白质翻译后修饰酶，主要定位于细胞核内，少量存在于细胞质内[3]。当细胞核DNA损伤或形成缺口时，PARP-1激活，而活化的PARP-1识别并结合DNA缺口，形成同型二聚体，催化尼克酰二核苷酸（NAD+）降解为烟酸和腺苷二磷酸（ADP），通过对受体蛋白的聚腺苷二磷酸糖基化的修饰作用及自身修饰和聚腺苷二磷酸糖基水解酶的作用，传递细胞受损程度，启动DNA修复系统，从而有效地修复DNA损伤[4]。在多种肿瘤中，PARP-1高表达提示患者预后较差。因此，本文就局部进展期直肠癌PARP-1表达与临床转归的关系作一探讨，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2008年1月至2012年11月浙江大学医学院附属邵逸夫医院收治的中低位局部进展期直肠癌患者50例，其中男35例，女15例；年龄61（43，80）岁；肿瘤位置：中位 20例，低位 30例；癌胚抗原≥5μg/L 23例，＜5μg/L 27例；放疗剂量 46.0（43.2，50.0）Gy；单药化疗 6 例，双药化疗 42 例；术前新辅助放化疗结束至手术时间8（4，12）周；术前新辅助放化疗结束至手术期间化疗周期：0个周期4例，1个周期30例，2个周期15例，3个周期1例；术后病理完全反应10例，无病理完全反应40例。纳入标准：（1）经肠镜病理检查确诊为直肠癌；（2）盆腔增强MRI检查及全身评估检查提示局部进展期且无远处转移；（3）接受术前新辅助放化疗+全直肠系膜切除术+术后辅助化疗。

1.2 随访情况 术后采取电话及门诊复查的随访方式，术后前3个月每月1次，之后每3个月1次随访患者的一般情况、副反应等，完善血常规、肿瘤标志物及盆腔MRI、胸部+上腹部CT等检查。截至2017年12月31日，中位随访时间为47.85个月。

1.3 PARP-1表达检测 采用免疫组化SP染色法。取患者治疗前肠镜活检肿瘤组织标本，脱水后用石蜡包埋制成切片（4μm厚），采用SP法检测PARP-1的表达水平，按照试剂盒说明书进行操作。由1位经验丰富的病理科医生在光镜下观察，每个视野计数100个肿瘤细胞，每张切片观察5个视野。细胞核内出现棕黄色颗粒的细胞即阳性细胞，阳性细胞占比=5个视野阳性细胞计数总和/500×100%，若＞60%为高表达，≤60%为低表达。单克隆抗体PARP-1购自美国Cell Signaling Technology公司，以阳性切片为对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。Kaplan-Meier法绘制生存曲线并计算生存率，组间比较采用log-rank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总体生存复发情况 50例患者中，13例发生转移复发，转移复发率为26.0%。中位无病生存期为46.75个月，1、3、5 年无病生存率分别为 94.0%、78.5%、62.1%，见图 1a；1、3、5年总体生存率为 98.0%、93.5%、90.6%，见图 1b。

图1 局部进展期直肠癌患者的生存曲线（a：无病生存率；b：总体生存率）

2.2 PARP-1表达检测结果 50例患者治疗前肿瘤组织中PARP-1高表达24例，见图2a；低表达26例，见图2b。

图2 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）高、低表达的免疫组化SP染色结果（a：高表达，阳性细胞占比＞90%；b：低表达，阳性细胞占比30%；×40）

2.3 PARP-1高、低表达患者术后转移复发及生存情况术后随访期间，PARP-1高表达组发生转移复发11例（22.0%），低表达组发生转移复发2例（4.0%），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；高、低表达组 1、2、3、4年无病生存率分别为87.5%、64.5%、55.3%、50.2%和100%、98.0%、98.0%、98.0%，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图 3。

图3 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）高、低表达患者的生存曲线

3 讨论

直肠癌是常见的恶性肿瘤，发病率很高[5]。随着直肠癌治疗方法的不断深入研究，术前放化疗联合全直肠系膜切除术已成为标准治疗手段，且较单纯手术治疗的生存获益更好[6]。另有Meta分析结果显示，直肠癌尤其是DUCKSⅡ、Ⅲ期患者，术前放化疗联合根治性切除术后复发率较直接手术治疗更低[7-8]。然而，在临床实践中发现，直肠癌术前放化疗的效果个体差异较大，肿瘤对放化疗的反应从完全缓解到完全抵抗均有存在。因此，寻找术前放化疗敏感性相关因素或灵敏的预测指标等，有助于指导直肠癌患者个体化治疗方案的选择，提高疗效，避免无效或过度治疗。

放疗引起的DNA损伤修复几乎在所有肿瘤细胞株中均可被发现，且与临床放射敏感性相关。也就是说，较难被治愈的肿瘤常常表现出较强的DNA损伤修复能力。2015年，托马斯·林达尔提出了“碱基切除修复”机制，现已成为DNA损伤修复机制的共识。PARP密切参与DNA单链损伤（SSB）和双链损伤（DSB）的碱基切除修复，其中PARP-1占聚腺苷二磷酸糖聚合酶家族中酶活性的90%以上[9]，因此笔者推测PARP-1有望成为评估直肠癌患者临床预后的生物标志物。当DNA发生断裂损伤时，PARP-1上的锌指结构会直接结合到SSB进行DNA缺口的识别，并通过锌Ⅲ活化形成同型二聚体。从而催化NAD+降解为烟酸和ADP，再以ADP为底物在受体蛋白上合成蛋白酶激活受体，调整其构象、稳定性和活性[10]。另一方面，PARP-1自带大量负电荷，又可招募并活化相关修复蛋白，如X线修复交叉互补组合-1（XRCC1）、DNA连接酶Ⅲ和 DNA聚合酶β，从而参与到DSB修复过程中[11]。Mazzotta等[12]采用免疫组化法检测114例乳腺癌患者PARP-1和乳腺癌易感基因1（BRCA1）蛋白的表达，结果发现PARP-1高表达与无病生存期和总生存期相关，可作为乳腺癌患者的独立预后因素。Xie等[13]采用免疫组化法检测111例术后接受铂类药物辅助化疗的非小细胞肺癌患者核苷酸剪切修复交叉互补基因1（ERCC1）、Muts同种组织蛋白2（MSH2）和PARP-1表达，结果发现ERCC1和PARP-1阴性患者较ERCC1或PARP-1阳性患者的总生存期明显延长，差异均有统计学意义。Liu等[14]对564例胃癌患者肿瘤组织中PAPR-1表达进行免疫组化检测，结果发现胃癌组织中PARP-1高表达与幽门螺杆菌感染、肿瘤分化差、肿瘤浸润深、淋巴结转移等密切相关；PARP-1高表达患者总生存率及无病生存率明显降低；提示PARP-1高表达是胃癌，特别是幽门螺杆菌阳性的胃癌患者预后不良的重要预测指标。目前有研究发现PARP-1抑制剂对BRCA1/2突变的乳腺癌及卵巢癌细胞有明显抑制作用，并具有放化疗增敏作用[15-16]。本研究结果显示，PARP-1高表达组术后转移复发率明显高于低表达组，1、2、3、4年无病生存率明显低于低表达组，差异均有统计学意义。

综上所述，治疗前PARP-1高表达，提示局部进展期直肠癌标准治疗后临床转归较差。