葛根素治疗去卵巢小鼠骨量丢失的疗效及对RANKL/RANK/OPG信号通路的影响

许晓山 庞正宝 杨军 周一峰 夏臣杰 丁心逸

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis,PMOP）是一类以骨量流失，骨微结构异常导致骨骼脆性增加的代谢性疾病。据统计，我国约有25.6%的50岁以上妇女患有PMOP[1]，并由此导致的脆性骨折发生率高达40%[2]。尽管市场上存在各类抗PMOP的药物，如二磷酸盐、活性维生素D等，但由于这些化学合成药物存在毒副反应且适应性不广，使得天然植物来源的中草药逐渐成了新药研发的热点[3]。葛根素是中药葛根最主要的活性成分之一，临床和动物实验发现，其能够有效延缓PMOP，改善机体骨量丢失[4-5]。葛根素的分子结构与雌激素相似，能够与破骨细胞上的雌激素受体结合，抑制破骨细胞的增殖、分化和成熟，影响骨吸收的过程[6-7]。然而，目前葛根素抗PMOP的分子靶点及相关的信号通路尚不清楚。雌激素缺乏导致成骨-破骨耦联失衡是PMOP重要的发病机制[8-9]。其中，核因子κB受体活化因子（receptor activator ofnuclear factor kappa-B ligand，RANKL）/核因子 κB 受体活化因子配体（receptor activator ofnuclear factor kappa-B,RANK）/骨保护素（osteoprotegerin,OPG）信号通路参与并调控破骨细胞的骨吸收功能，与PMOP的发生、发展密切相关[10]。本实验通过葛根素干预去卵巢骨质疏松小鼠模型，验证葛根素防治PMOP的疗效，并进一步探讨其对破骨细胞和RANKL/RANK/OPG信号通路的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雌性12周龄C57BL/6小鼠30只，体重（24±2）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 药物、试剂及仪器 戊巴比妥粉（中生瑞泰科技有限公司，批号：921019）；4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司，批号：P1110）；固绿染液（北京索莱宝科技有限公司，批号：G2551）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，Trap）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：G1492）；核酸检测试剂盒（日本Takara公司，批号：9534）；β-Ⅰ型胶原交联羧基末端肽（β-cross-linked C-terminal telopeptide of type I collagen，β-CTX）ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：H287）；抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase 5b，Trap5b）ELISA 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：H377-1-1）；骨形态计量仪（美国Osteometrics公司）；荧光定量PCR仪（美国Termor公司）；蔡司显微镜（德国Zeiss公司）；微型计算机断层扫描（micro computed tomography，Micro-CT）仪（型号：Skyscan 1170，比利时 Bruker公司）。

1.3 小鼠造模及分组药物干预 采用随机数字表法将30只小鼠分为假手术组、模型组和葛根素治疗组，每组10只。小鼠接受0.3%戊巴比妥（0.1 ml/10 g）腹腔注射麻醉后，常规剃毛消毒。于背部正中线作长约1.5 cm的切口，沿背部肋弓缘、腰椎旁逐层进入腹腔，暴露两侧卵巢及输卵管。模型组和葛根素治疗组小鼠切除双侧卵巢并结扎输卵管，假手术组小鼠去除卵巢周围等量的脂肪组织。检查无活动性出血，逐层缝合伤口。术后连续2 d腹腔注射青霉素。第3天起开始药物干预。根据成人与小鼠的体表面积药物换算比例，葛根素治疗组小鼠予100 mg/kg剂量的葛根素（溶于0.4 ml 0.9%氯化钠溶液）灌胃干预，隔天1次，持续8周。模型组小鼠给予0.4 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃，隔天1次，持续8周。假手术组小鼠不作处理。

1.4 Micro-CT检测 造模8周后，获取各组小鼠右侧股骨组织，剔除周围的肌肉和韧带。将样本放置于Micro-CT仪内，进行扫描及图像重构。具体检测参数如下：骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数目（Tb.N）和骨小梁间距（Tb.Sp）。

1.5 血清β-CTX和Trap5b水平检测 采用ELISA法。造模8周后，摘除小鼠眼球取全血约0.8 ml。静置2 h后，4℃1 500 r/min离心30 min，取上清液0.4 ml。按照ELISA试剂盒说明书检测血清β-CTX和Trap5b水平。

1.6 Trap染色及定量分析 扫描完毕后，将股骨组织置于4%多聚甲醛中固定48～72 h。随后将样本进行脱钙、脱水及石蜡包埋处理，制作成3μm厚的石蜡切片。完成脱蜡复水后，按照Trap染色试剂盒操作手册，先后将切片置于Trap孵育液反应60 min和甲基绿染液染色3 min。纯水清洗，95%乙醇梯度脱水，二甲苯透明，透明树脂封片。使用骨形态计量仪对破骨细胞数量和骨小梁面积分数进行定量分析。

1.7 3组小鼠股骨组织RANKL和OPG mRNA表达水平检测 采用qRT-PCR法。获取小鼠左侧股骨，PBS反复清洗3遍，采用Trizol法萃取总mRNA。根据核酸检测试剂盒操作手册，获取建立10μl反应体系，并置于PCR仪中进行荧光定量检测。RANKL上游引物：5'-CCTGAGACTCCATGAAAACGC-3'， 下 游 引 物 ：5'-TAACCCTTAGTTTTCCGTTGC-3'；OPG 上 游 引 物 ：5'-TCCTGCCACCTACCTAAAACAGCA-3'，下游引物：5'-CTACACTCTCGGCATTCACTTTGG-3'。循环参数设置：预变性95℃ 5 min，变性 95℃ 30 s，退火57℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s；循环33次。

1.8 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠Micro-CT骨微结构参数结果比较 与假手术组比较，模型组小鼠BMD、BV/TV、Tb.N均减少，Tb.Sp增宽，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；葛根素治疗组Tb.N减少，Tb.Sp增宽，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与模型组比较，葛根素治疗组小鼠BMD、BV/TV、Tb.N均增加，Tb.Sp变窄，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见表 1。

表1 3组小鼠Micro-CT骨微结构参数结果比较

2.2 3组小鼠血清β-CTX和Trap5b水平比较 与假手术组比较，模型组小鼠血清β-CTX和Trap5b水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，葛根素治疗组小鼠血清β-CTX和Trap5b水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 3组小鼠血清β-CTX和Trap5b水平比较

2.3 3组小鼠Trap染色及骨组织形态定量分析结果比较 Trap染色结果显示：模型组小鼠骨小梁结构稀疏、紊乱，部分骨质断裂，破骨细胞数量增加；葛根素治疗组小鼠骨小梁增粗变壮，破骨细胞数量减少，见图1（插页）。骨组织形态定量分析结果显示：与假手术组比较，模型组小鼠破骨细胞数量增加，骨小梁面积分数减小，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，葛根素治疗组小鼠破骨细胞数量减少，骨小梁面积分数变大，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 3组小鼠骨组织形态定量分析结果比较

图1 3组小鼠股骨病理检查所见[a：假手术组；b：模型组；c：葛根素治疗组；破骨细胞呈现红色（由黑色箭头标记），骨小梁呈现绿色；抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）染色，×100]

2.4 3组小鼠股骨组织RANKL和OPG mRNA表达水平比较 与假手术组比较，模型组小鼠股骨组织RANKL mRNA表达水平升高，OPG mRNA表达水平、OPG/RANKL比值均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，葛根素治疗组小鼠股骨组织RANKL mRNA表达水平降低，OPG mRNA表达水平、OPG/RANKL比值均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 3组小鼠股骨组织RANKL和OPG mRNA表达水平比较

3 讨论

骨骼是一类动态的活性组织，即成骨细胞介导骨形成与破骨细胞介导骨吸收时刻处于动态平衡，使骨组织不断更新，以维持骨骼的强度和弹性[11]。雌激素缺乏会持续激活破骨细胞，打破成骨-破骨耦联平衡，使骨的吸收远大于骨的形成，最终导致PMOP的发生、发展。

RANKL/RANK/OPG信号通路在破骨细胞活化及骨吸收中发挥重要的调节作用[12]。RANKL与破骨细胞表面上的RANK结合，促进其分化、成熟和活化，并抑制其凋亡。OPG可竞争性阻止RANKL与RANK的结合，起负调节作用，抑制破骨细胞的骨吸收。OPG/RANKL比值能够有效地反映骨重建过程中破骨细胞的骨吸收功能，是评估成骨-破骨耦联平衡重要的依据[13]。研究表明敲除RANKL基因或过表达OPG基因，会抑制骨的吸收，显著增强机体骨量[14-15]。因此，RANKL/RANK/OPG信号通路是防治PMOP重要的分子靶点。

葛根素是中药葛根主要的成分，其分子结构与雌激素相似，具有雌激素样活性，能够提高机体的BMD和骨量。但与雌激素不同，葛根素不会增加乳腺癌、子宫癌等发生风险，具有成为理想抗PMOP药物的潜力。细胞实验发现，葛根素通过调控RANKL/RANK/OPG信号通路，可影响破骨前体细胞的增殖、分化和成熟[5，16]。由此提示，葛根素能够有效缓解PMOP极有可能是通过作用于RANKL/RANK/OPG信号通路，进而抑制破骨细胞的骨细胞功能实现的。

本研究应用成熟的去卵巢小鼠模型来模拟妇女PMOP的生理状态。Micro-CT结果显示：模型组小鼠BMD下降，骨微结构破坏明显，提示PMOP小鼠模型成功建立。葛根素能够有效减少去卵巢小鼠骨量丢失，缓解PMOP的进展。血清ELISA结果显示：模型组小鼠血清中β-CTX和Trap5b水平增加，提示骨吸收增强；葛根素能够有效降低去卵巢小鼠β-CTX和Trap5b水平，抑制破骨细胞的骨吸收。Trap染色结果显示：造模组小鼠存在大量的破骨细胞，骨小梁稀疏、破坏；葛根素治疗后，破骨细胞的数量减少，骨小梁变壮增粗。上述结果提示：葛根素治疗去卵巢小鼠骨质疏松可能是通过抑制破骨细胞介导的骨吸收过程实现的。进一步qRTPCR结果显示：去卵巢造模后，小鼠股骨RANKL mRNA表达水平升高，OPG mRNA表达水平、OPG/RANKL比值降低，可导致破骨细胞数量增加、活性增强。葛根素能够促进OPG表达，降低RANKL表达，改善OPG/RANKL比值，抑制破骨细胞的形成和吸收功能。

综上所述，葛根素可以促进骨组织中OPG表达，抑制RANKL表达，降低OPG/RANKL比值，从而抑制破骨细胞的功能，防治去卵巢小鼠骨量丢失和骨微结构破坏。但本研究尚存在若干不足：（1）本研究未通过细胞实验来进一步明确葛根素对破骨细胞的体外分化及活性的影响；（2）动物实验过程中未增设高、中、低剂量组来明确葛根素的最佳药物浓度；（3）整个实验主要从骨吸收角度研究葛根素抗骨质疏松疗效及作用机制，缺少其对成骨细胞及骨形成影响的论述。