多发性骨髓瘤预后相关基因的鉴定及核心基因CLDN1的机制探讨

龚高明 陈博 舒鹏

随着靶向药物的不断开发，多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的预后得到了显著改善，但MM仍是一种不可治愈的疾病[1]。因此寻找MM的治疗靶点，进一步开发靶向治疗药物，从而改善患者的预后成为研究的热点[2]。在患者治疗靶点的分析中，除去对患者本身的临床病理因素进行分析外，近年来通过对患者肿瘤组织样本的测序数据进行分析，明确肿瘤组织中的基因表达与患者预后因素之间的关联，并进一步应用于临床病例的诊断、肿瘤靶点开发的这一流程已得到广泛的认可[3]。目前已有多项研究得出了与MM患者生存率相关的预后基因[4]。尽管如此，有关这些预后基因如何影响MM患者肿瘤细胞生物学特性的研究则相对较少。本研究通过Cox预后模型分析基因表达与MM患者整体生存率之间的相关性，并得到预后相关基因，同时进行相应的机制探讨。

1 材料和方法

1.1 试剂 RPMI 1640（11875-085）培养基、DMEM（11530556）培养基、FBS（10438026）均购自美国Gibico公司；小干扰 RNA（small interfering RNA,siRNA）购自美国Sigma 公司；PMD2.G（12259）、psPAX2（12260）、lenti－CRISPR V2（52961）均购自美国addgene公司；Lipofectamine2000（12566014）、qRT-PCR实验中Trizol（15596026）均购自美国Thermo Fisher公司；反转录试剂盒PrimeScript RTReagent Kit with gDNA Eraser（RR047A）、SYBR检测试剂盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TliRNaseHPlus）（RR820A）均购自北京宝日医生物技术有限公司，实验中全部引物均由华大基因合成；在Western blot实验中，RIPA强裂解液（P0013B）购自上海碧云天生物技术有限公司；紧密连接蛋白 1（claudin1,CLDN1）（ab63070）、转化生长因子-β3（transforming growth factor beta 3,TGF-β3）（ab15537）、GAPDH（ab9485）抗体均购自美国 Abcam公司；Transwell小室（BMS500FI-100）购自美国Corning公司；CCK-8（CK04）增殖检测试剂购自日本同仁化学研究所；Annexin V FITC/PI（BMS500FI-100）凋亡检测试剂盒购自美国eBioscience公司；CD138+磁珠分选试剂盒购自美国STEMCELL Technologies公司。

1.2 预后相关基因的确定与验证 MM预后相关基因的确定使用R 3.5.1软件完成，选取GSE2658数据集为训练数据集，GSE57317数据集为测试数据集。训练与测试数据集均使用GEOquery包下载后，log2转换并使用preprocessCore包进行标准化，训练数据集随后进行如下操作：（1）使用randomForest包中的随机森林对基因的重要性进行排序；（2）进一步使用多因素Cox模型，最终得到25个预后相关基因，使用survival包中的多因素Cox模型检测训练数据集与测试数据集中25个基因的表达与MM患者总体生存率的关联，并使用ROC的时间序列分析（timeROC）工具包评估模型对不同时间点生存预测的性能，随后使用qRT-PCR检测25个基因在MM患者CD138+细胞中的表达；（3）在得到候选基因CLDN1后，使用survival包中的单因素Cox模型检测测序数据中CLDN1的表达与MM患者总体生存率的关联；（4）根据CLDN1的表达值，将GSE2658数据集中样本分为高表达组与低表达组，并使用limma包进行差异表达分析，以P＜0.001为标准筛选基因，最终得到779个异常表达基因，使用fgsea包进行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），并对富集通路中的基因使用cor.test计算相关系数。

1.3 细胞培养 3例健康志愿者、7例MM患者骨髓样本均来自宁波市北仑区人民医院，样本收集时间为2015年11月至2017年11月，实验过程经医院医学伦理委员会审批通过。健康志愿者、MM患者骨髓在经Ficoll分离出单个核细胞后，MM患者骨髓使用CD138+磁珠分选试剂盒分选出CD138+细胞待用。人MM细胞系RPMI8226细胞（北京协和细胞资源中心）培养于含10% FBS的RPMI 1640培养基中，培养条件为37℃、5% CO2。人胚肾细胞系293t细胞（美国ATCC公司）培养于含10% FBS的DMEM培养基中，培养条件为37℃、5% CO2。

1.4 CLDN1敲除慢病毒包装、单克隆筛选以及TGF-β3 siRNA转染 从addgene human GECKOV2 library库中提取CLDN1单引导核糖核酸（single guide RNA,sgRNA）序列，选取6条sgRNA，按照相应的操作步骤克隆至lentiCRISPR V2载体中[5]。使用第三代慢病毒包装体系将sgRNA包装为慢病毒，主要步骤如下：（1）PMD2.G、psPAX2、lentiCRISPR V2 分别取 3、9、12 μg，转染至293t细胞中。（2）收集36、48 h病毒上清液，混在一起低速离心（3 000 rpm，15 min）后，使用病毒上清液感染RPMI8226，标记为RPMI8226 KO组；RPMI8226细胞同时感染lentiCRISPR V2空载病毒，标记为RPMI8226 CON组。RPMI8226 CON组与RPMI8226 CLDN1 KO组在使用8.5×10-6mol/L浓度的嘌呤霉素筛选48 h后，使用BD FACSARIA III单细胞分选功能筛选单克隆细胞，并使用Sanger测序检测DNA突变变化，使用Western blot检测CLDN1蛋白水平的抑制，最终确定序列为5'-GGCGGTCACGATGTTGTCGC-3'的sgRNA阻断了RPMI8226细胞中CLDN1的表达。（3）在CLDN1与TGF-β3关联的验证中，将RPMI8226细胞分为RPMI8226 CON 组、RPMI8226 CLDN1 KO 组、RPMI8226 TGF-β3 siRNA组、RPMI8226 CLDN1 and TGF-β3 siRNA组，并分别转染lentiCRISPR V2空载体、CLDN1 sgRNA、TGF-β3 siRNA 和 CLDN1 sgRNA+TGF-β3 siRNA，TGF-β3 siRNA转染使用lipofectamine 2000进行，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.5 健康志愿者骨髓单个核细胞与MM患者CD138+细胞中CLDN1 mRNA表达水平检测 采用qRT-PCR法。健康志愿者骨髓单个核细胞与MM患者CD138+细胞首先使用Trizol裂解，经氯仿分离出苯酚、等体积异丙醇沉淀出细胞总RNA后，使用反转录试剂盒将总mRNA反转录为cDNA。以GAPDH为内参，通过SYBR染料法检测目的基因在mRNA水平的表达。GAPDH上游引物：5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，下游引物：5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'；CLDN1 上游引物：5'-GTCTTTGACTCCTTGCTGAATCTG-3'，下游引物：5'-CACCTCATCGTCTTCCAAGCAC-3'。反应体系为cDNA 1.2 μl，引物 1.2 μl，2×qPCR Mix 7.5 μl，ROX DyeⅡ 0.3 μl，水 4.8 μl，总反应体系为 15 μl；反应条件为50 ℃ 20 s，95℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，后两步40个循环。最终mRNA的相对表达量使用2-ΔΔCT法定量。

1.6 CLDN1、TGF-β3蛋白表达水平检测 采用Western blot法。细胞使用RIPA裂解液冰上裂解30 min后，使用BCA蛋白定量试剂盒定量，加入相应比例的上样缓冲液，沸水浴15 min后，取20μg蛋白加入到Western预制胶中，恒压电泳直至溴酚蓝跑至胶板底部，并使用湿法转膜将蛋白转至PVDF膜，标记相应一抗与二抗，使用ECL发光液检测信号的强度以判定蛋白的表达。

1.7 细胞凋亡检测 采用Annexin V FITC/PI双染法。PBS清洗细胞后，使用Binding buffer重悬，并加入Annexin V FITC与PI，冰上标记10 min后，流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。数据使用FLOWjo 7.6.1进行分析。

1.8 细胞迁移检测 采用Transwell法。选用8μm Transwell小室，上室加入无血清培养基重悬的细胞，下室加入含有血清的培养基，12 h后吸取下室培养基，计数得到迁移细胞数目。

1.9 细胞增殖检测 采用CCK-8法。将细胞铺于96孔板中，并设立 4 个副孔，于 0、24、48、72、96 h 分别加入1/10体积的CCK-8试剂，37℃避光孵育4 h后，使用酶标仪检测 450 nm处的吸光度（OD）值（OD450），并以0 h时的OD450为参照，其余时间点OD值均与0 h时相除得到增殖指数。

1.10 统计学处理 采用R 3.5.1统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。生存分析采用单因素Cox回归分析。样本的相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MM患者25个基因预后模型的建立及与患者预后的相关性 本研究得到25个与患者整体生存率相关的预后基因，分别为 NNAT、TRAPPC8、IFI27L1、PNOC、HJURP、KRT6B、METTL7A、C16orf45、CENPA、TPT1P8、TYROBP、MSN、RFC4、DSPP、PABPC1、TNFSF12、C3orf52、CLDN1、RPS9、CSTF3、CDKN1A、SLC25A43、HPRT1、VDAC3、FZD3。以25个基因组合得到的预后模型在训练（图1a）与测试数据集（图1b）中均能够很好地预测患者的总体生存率，且在患者1～3年生存率的预测中也有很好的表现（AUC 均＞0.7）（图 1c）。

图1 多发性骨髓瘤（MM）患者25个基因预后模型的建立及与患者预后的相关性（a：使用Cox模型得到的25个预后相关基因在GSE2658数据集中与患者总体生存率的相关性；b：在测试数据集中验证25个预后基因与患者总体生存率的相关性；c：在测试数据集中，25个预后基因对患者0.5、1、1.5、2、2.5、3年生存率的预测能力的比较）

2.2 MM患者CD138+细胞中CLDN1的表达情况及与患者预后的相关性 MM患者CD138+细胞中CLDN1 mRNA表达水平为4.89±0.63，高于健康志愿者骨髓单个核细胞的 1.00±0.12，差异有统计学意义（t=3.11，P＜0.01）（图2a）。同时MM患者CD138+细胞中CLDN1蛋白水平呈高表达（图2b）。在训练数据集中，CLDN1高表达组患者生存率明显低于CLDN1低表达患者（P＜0.01）（图 2c）。

2.3 CLDN1的表达水平与MM细胞系细胞生物学特性的关联 在确定了CLDN1在CD138+细胞中的表达后，随后构建了CLDN1敲除单克隆，结果表明CLDN1 sgRNA抑制了CLDN1蛋白水平的表达（图3a）。而RPMI8226 CON组细胞凋亡比例为2.40±0.23，明显低于RPMI8226 CLDN1 KO组的17.67±2.77，差异有统计学意义（t=8.55，P＜0.01）（图 3b）。在细胞增殖中，72 h时RPMI8226 CON组增殖指数为4.87±1.56，明显高于RPMI8226 CLDN1 KO组的 2.51±0.18，差异有统计学意义（t=9.94，P＜0.01）；96 h时 RPMI8226 CON 组增殖指数为6.86±0.12，明显高于RPMI8226 CLDN1 KO组的 3.06±0.25，差异有统计学意义（t=23.73，P＜0.01）（图3c）。在细胞迁移中，12 h时RPMI8226 CON组迁移细胞数为2 063±241.9，明显高于RPMI8226 CLDN1 KO 组的 1 197±166.9，差异有统计学意义（t=2.95，P＜0.05）（图 3d）。

图3 紧密连接蛋白1（CLDN1）的表达水平与骨髓瘤细胞系细胞生物学特性之间的关联（a：RPMI8226 CON组与RPMI8226 CLDN1 KO组CLDN1蛋白表达水平比较；b：RPMI8226 CON组与RPMI8226 CLDN1 KO组细胞凋亡比例比较；c：RPMI8226 CON组与RPMI8226 CLDN1 KO组细胞增殖指数比较；d：RPMI8226 CON组与RPMI8226 CLDN1 KO组迁移细胞数比较；与RPMI8226 CON组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 CLDN1调控的信号通路探讨 在确定了CLDN1与RPMI8226细胞生物学特性的关联后，在GSE2658数据集中选取CLDN1高表达与低表达样本，使用GSEA方法检测细胞通路的富集，结果表明细胞外基质相关通路在CLDN1高表达样本中富集（图4a），检测CLDN1与细胞外基质分子（GO:0031012）表达相关性后，发现CLDN1与TGF-β3的表达呈正相关（r=0.27，P＜0.01）（图 4b和表 1）。RPMI8226随后转染 TGF-β3 siRNA，结果表明CLDN1的表达受限（图4c），使用Transwell小室检测 RPMI8226 CON组、RPMI8226 CLDN1 KO 组、RPMI8226 TGF-β3 siRNA 组、RPMI8226 CLDN1 and TGF-β3 siRNA组细胞迁移的变化后，结果发现CLDN1的敲除、TGF-β3的抑制均能抑制RPMI8226细胞的迁移，而同时抑制CLDN1与TGF-β3能够进一步抑制RPMI8226细胞的迁移能力（图4d）。

表1 细胞外基质分子（GO:0031012）中与CLDN1表达相关的基因

图4 紧密连接蛋白1（CLDN1）调控的信号通路的探讨[a：在GSE2658数据集中，筛选出CLDN1高表达与低表达样本后，使用基因富集分析（GSEA）检测通路的富集；b：GSE2658数据集中CLDN1与转化生长因子-β3（TGF-β3）表达的相关性；c：RPMI8226细胞在转染TGF-β3小干扰 RNA（siRNA）后，CLDN1、TGF-β3 蛋白表达的电泳图；d：RPMI8226 CON 组、RPMI8226 CLDN1 KO 组、RPMI8226 TGF-β3 siRNA组、RPMI8226 CLDN1 and TGF-β3 siRNA组细胞迁移的变化比较，与RPMI8226 CON组比较，*P＜0.05，**P＜0.01]

3 讨论

MM目前仍为预后较差的一种恶性疾病，我国患者中位生存期仅为3年，仅有少数患者能够存活10年以上[6]。与此同时MM也是最早应用靶向治疗药物的疾病之一，通过对MM发病过程中特异的通路进行靶向治疗能够起到很好的效果，如2014年的一项研究中，在130例成人MM患者中应用蛋白酶体抑制剂硼替佐米，使得1例患者达到完全缓解、49例患者达到部分缓解[7]。然而随着肿瘤细胞的不断演化，多种基因如PSMB5 A49T、C52F等位点突变介导的耐药也备受关注[8]，而明确新的预后相关基因，并开发新的靶点成为研究的热点。

本研究通过Cox生存分析与随机森林算法结合的方式，得到了25个与患者总体生存率显著相关的基因，而由该25个预后相关基因构建的预后模型，在对患者 0.5、1、1.5、2、2.5、3 年生存率的预测中，该模型的AUC在0.5年最高，在3年总体生存率的预测中依然具有很好的性能。通过在本院MM样本验证，25个基因中，CLDN1在7例MM患者中的mRNA与蛋白水平均呈现高表达，与此同时CLDN1的表达与患者的总体生存率高度相关，因此笔者选定CLDN1进行进一步的验证。

目前已有的研究中，CLDN1又称Claudin 1，属于跨细胞膜蛋白家族，其主要功能与细胞之间的紧密连接相关[9]，因此也被证实与细胞增殖、转移[10]、上皮-间质转化[11]等进程密切相关。MM中CLDN1的具体功能与机制尚未有报道，通过构建CLDN1敲除细胞系，笔者证实了CLDN1的表达与MM细胞系的增殖、凋亡、迁移高度相关，初步证实了CLDN1的表达水平决定了MM细胞系的生物学特性，可能为MM的驱动基因之一。因此笔者随后在测试数据集中调取CLDN1的表达数据并计算细胞通路的富集，结果表明细胞外基质成分相关通路在CLDN1高表达样本中异常富集，随后调取该通路（GO:0031012）中的所有基因，并与CLDN1表达数据进行相关性分析，得出TGF-β3与CLDN1的表达呈正相关。TGF-β3属于TGF-β家族，已被证实与MM的发病相关[12]。同时在结肠上皮细胞系中TGF-β家族的TGF-β1能够诱导CLDN1的表达，因此笔者认为TGF-β3可能通过同样的机制调控CLDN1的表达[13]。笔者向RPMI8226细胞系中转染了TGF-β3 siRNA，通过Western blot确定了敲低效率后，进一步证实了TGF-β3的抑制能够降低CLDN1的表达，初步证实TGF-β3对CLDN1的调控，而在细胞迁移实验中，TGF-β3、CLDN1的抑制均能降低细胞的迁移能力，且两者具有协同作用。

综上所述，本研究确定了25个预后相关基因对患者生存的预测作用，并确定了其中与肿瘤发展密切相关的癌基因CLDN1，同时初步证实了CLDN1与TGF-β3之间的相关性，为进一步开发靶向药物提供了基础。