干扰素α 对人骨肉瘤U2OS 细胞化疗敏感性的影响

2021-03-27黄秀芳原向伟陈忠羡

中国医药导报 2021年6期

黄秀芳原向伟秦英陈忠羡

1.中山大学附属江门医院（江门市中心医院）病理科，广东江门 529030；2.中山大学附属江门医院（江门市中心医院）脊柱骨科，广东江门 529030

骨肉瘤是骨组织原发肿瘤中最常见的恶性肿瘤[1]，虽然发病率偏低，但其多发于青少年，恶性度极高，预后不佳[2]。顺铂常用于骨肉瘤患者的化疗，但因耐药和毒性作用等问题常影响其疗效[3-4]。干扰素α（IFN-α）已用于治疗多种肿瘤[5-6]，但其对骨肉瘤化疗敏感性的影响罕有报道。本研究探讨IFN-α 对人骨肉瘤U2OS细胞化疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与试剂

U2OS 细胞来自中山大学病理学教研室，培养液为DMEM（GIBCO）[含10%胎牛血清（GIBCO）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素]，5%CO2培养箱37℃培养。IFN-α 为Peprotech 产品；台盼蓝、顺铂购自Sigma；Z-VAD-FMK 为Calbiochem 产品；DNAzol 购自Invitrogen；Caspase-3（sc-7272）、Caspase-8（sc-56070）、Caspase-9（sc-56077）和GAPDH（sc-47724）等抗体购自Santa Cruz。

1.2 台盼蓝拒染法

细胞经0.4%台盼蓝染色，蓝染为死细胞，活细胞拒染，细胞生长抑制率=（对照组活细胞数－实验组活细胞数）/对照组活细胞数×100%。

1.3 Hoechst 33258 荧光染色

U2OS 细胞4℃固定10 min 后1000 r/min 离心5 min，加Hoechst 33258 避光染15 min，荧光显微镜下计数细胞，凋亡率=凋亡细胞数/视野全部细胞数×100%。

1.4 DNA Ladder

U2OS 细胞加DNAzol，4℃，12 000 r/min 离心15 min，取上清加无水乙醇4℃，10 000 r/min 离心10 min；加75%乙醇清洗，溶于TE，琼脂糖凝胶电泳成像。

1.5 Western blot

提取蛋白经SDS-PAGE 电泳后电转至PVDF 膜，TBST 4℃封闭过夜；一抗浓度均为1∶1000 稀释，室温封膜3 h，二抗4℃过夜，ECL 发光，Image J 计算灰度，实验重复3 次。

1.6 统计学方法

采用SPSS 15.0 统计分析数据，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFN-α 对顺铂诱导U2OS 细胞生长抑制的影响

IFN-α 组（5000 U/mL）、顺铂组（5 μmol/L）、IFN-α+顺铂组细胞生长抑制率均高于对照组，IFN-α+顺铂组细胞生长抑制率高于顺铂组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。见图1。

图1 IFN-α 对顺铂诱导U2OS 细胞生长抑制的影响（n=3）

2.2 IFN-α 对顺铂诱导U2OS 细胞凋亡的影响

对照组、IFN-α 组细胞无明显凋亡，顺铂组部分细胞出现凋亡变化如核浓染碎裂等，IFN-α+顺铂组凋亡细胞明显增加，见图2。对照组、IFN-α 组、顺铂组和IFN-α+顺铂组的细胞凋亡率分别为（1.63±1.03）%、（4.26±2.19）%、（17.85±3.66）%和（52.55±4.89）%，IFN-α+顺铂组细胞凋亡率高于顺铂组，差异有统计学意义（χ2=17.02，P<0.01）。

图2 IFN-α 对顺铂诱导U2OS 细胞凋亡的影响（400×）

2.3 联合用药对DNA 梯形条带的影响

DNA 梯形条带是凋亡的特征性表现[7]，与其他组比较，IFN-α+顺铂组出现明显梯形条带。见图3。

图3 联合用药对DNA 梯形条带的影响

2.4 IFN-α 对顺铂引起Caspase-3、8、9 表达的影响

在顺铂组，Caspase-3、8、9 仅有微弱的活化，而在IFN-α＋顺铂组，三者均出现明显的活化裂解。见图4。与顺铂组比较，IFN-α+顺铂组各活性片段的表达增加，差异有高度统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.5 联合用药的生长抑制依赖Caspase

经泛Caspase 抑制剂Z-VAD-FMK 预处理后，IFN-α+顺铂+Z-VAD-FMK 组细胞生长抑制率低于IFN-α+顺铂组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见图5。

图4 IFN-α 对顺铂引起Caspase-3、8、9 表达的影响

3 讨论

IFN-α 通过JAK/STAT 通路发挥生物学功能[8-10]，可在胃癌、乳腺癌、肺癌、白血病中引起生长抑制和凋亡[11-14]，还增强放、化疗引起的生长抑制[15-16]。联合生物治疗与其他治疗，可望达到“1+1＞2”的疗效[17-18]。本研究表明，IFN-α 明显增强顺铂的生长抑制，提示了IFN-α 在骨肉瘤治疗中的价值。虽然IFN-α 可抑制耐药骨肉瘤细胞[5]，但其仅轻微抑制U2OS 细胞，这可能因为IFN-α 的抑制作用依赖ARF 基因[19]，而U2OS细胞中ARF 表达缺失[20]。

IFN-α 和顺铂均可诱导肿瘤细胞凋亡[21]，因此IFN-α 的增敏作用可能涉及凋亡。形态学和DNA ladder 表明IFN-α 的确通过凋亡增强U2OS 细胞对顺铂的敏感性。Caspase 是执行细胞凋亡的关键蛋白酶[21]，Caspase-8、9 位于起始阶段，两者活化后裂解效应性Caspase-3，信号逐级传递，直至完成凋亡[22-24]。本研究中Caspase-3、8、9 均出现明显活化，证明IFN-α可能通过Caspase 级联活化增强顺铂诱导的凋亡。而用泛Caspase 抑制剂Z-VAD-FMK 预处理可显著减弱该效应，表明其依赖于Caspase 的功能。而Caspase通常位于凋亡信号通路的末端，在其上游，必然存在IFN-α 诱导的起始因子改变，STAT 基因家族是候选因子之一[8]，相关研究尚需进一步深入。