三阴性乳腺癌组织亲嗜性病毒整合位点1和核转运蛋白基因2的表达及与临床病理特征和预后的关系

牛悦，石磊，张霆，孙新增，白建平

（中国人民解放军联勤保障部队第983医院 普外科，天津300142）

三阴性乳腺癌（three negative breast cancer,TNBC）是指雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）、人类表皮生长因子受 体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）表达均阴性的乳腺癌，占所有乳腺癌类型的12%～17%[1]。TNBC 是高侵袭性、异质性恶性肿瘤，恶性程度高，临床缺乏内分泌和靶向治疗药物，治疗后易复发，耐药患者预后差，是病死率最高的乳腺癌亚型[2]。因此，探讨与TNBC 的发生、发展、侵袭、转移等恶性行为相关的分子机制对改善患者的预后具有重要意义。亲嗜性病毒整合位点1（ecotropic virus integration site-1, EVI1）是一种原癌基因，具有双结构域的锌指转录因子，参与白血病细胞的分化、凋亡和增殖，在髓系白血病中高度表达[3]。核转运蛋白基因2（karyopherin-α2, KPNA2）是核转运蛋白家族的一员，参与多种肿瘤相关蛋白的核转运途径，在结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤中过表达，与不良预后有关[4-5]。有关EVI1、KPNA2 在TNBC 的表达的报道较为少见，其是否与TNBC 高度侵袭性和不良预后有关尚不明确，鉴于此，本研究拟通过检测TNBC 患者癌组织、癌旁组织中EVI1、KPNA2 的表达，分析其与临床病理特征的关系，以探讨EVI1、KPNA2 在TNBC 恶性进展中的作用机制，为TNBC 的临床治疗和预后预测提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2012年1月—2015年1月中国人民解放军联勤保障部队第983 医院收集的73 例TNBC 患者手术切除的癌组织、癌旁组织（距离癌组织>5 cm）及70 例正常乳腺组织（对照组）的石蜡标本。乳腺癌患者年龄46～63 岁，平均（55.23±7.31）岁；乳腺肿块直径0.62～3.56 cm，平均（2.13±0.34）cm；组织学分级：Ⅰ级20 例，Ⅱ级16 例，Ⅲ级37 例；淋巴结：N033 例，N1、N240 例；脉管内癌栓44 例；Ki-67低表达33 例，Ki-67 高表达40 例。对照组年龄42～60 岁，平均（54.35±3.15）岁，均为女性。纳入标准：①ER、PR、HER2表达阴性和/或荧光原位杂交HER2/Neu基因无扩增，经病理组织学诊断为TNBC；②病理类型均为浸润性导管癌；③病理资料完整，接受随访；④标本均来自女性患者，年龄≥18 岁。排除标准：①术前未进行化疗、放疗、免疫治疗；②男性患者；③Luminal 型、Her-2 型、Basal-like 型等其他类型乳腺癌；④有远处转移者。乳腺癌患者和对照组的年龄和性别比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，审批号[伦（审）S20121127]。

1.2 免疫组织化学方法检测EVI1、KPNA2的表达

标本在37℃避光下经3.7%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，制作4 μm厚切片，二甲苯中脱蜡，乙醇梯度水化，蒸馏水洗涤。108℃高压2 min，3%过氧化氢/甲醇溶液室温下阻断内源性过氧化物酶活性15 min，1%稀释正常马血清（购自北京太阳红科技有限公司）37℃下孵育30 min，阻断非特异性抗体结合，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后加入EVI1 多克隆抗体、KPNA2 兔抗人多克隆抗体（均购自英国Abcam 公司），37℃孵育60 min，4℃冰箱孵育过夜。PBS 冲洗3 次加二抗，37℃孵育17 min，PBS冲洗3 次，链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）（购自福建迈新生物技术开发公司）显色3～5 min，37℃孵育30 min，二氨基联苯胺（DAB）（购自福建迈新生物技术开发公司）显色3～5 min。再经苏木精复染、脱水、透明封固，光学显微镜随机选取5个高倍视野进行观察，放大倍数为400 倍。以PBS代替一抗为阴性对照。

1.3 结果评定

在双盲条件下，该院病理科2 位具有副主任职称的病理医师分别采用半定量法进行等级评定[6]，胞浆和/或细胞核中的淡黄色至棕色颗粒被定义为阳性。随机从各组选择3 个切片，每个切片随机选取5 个高倍视野观察，先进行染色密度评分，阴性为0 分，弱阳性为1 分，中度阳性为2 分，强阳性为3 分。再进行阳性细胞百分比评分，阴性为0 分，<25%为1分，25%～<50%为2分，50%～<75%为3分，≥75%为4 分。染色密度评分与阳性细胞百分比评分的乘积为免疫反应评分（IRS），0 分为阴性（-），1～4 分为弱阳性（+），5～8 分为阳性（++），9～12 分为强阳性（+++）。

1.4 随访

患者均定期门诊复查，采用电话或微信随访，记录随访期间无进展生存时间（PFS）及总生存时间（OS）的生存率，PFS 指手术日起到肿瘤复发或转移或随访截止时间，OS 指手术日起到患者死亡或随访截止时间。复发、转移指经影像及病理证实的原发肿瘤局部或远处器官转移。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件，计数资料以构成比或率（%）表示，比较采用χ2检验，两两比较采用χ2分割法（检验水准α=0.013），Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较用Log-Rank χ2检验；P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNBC癌组织中EVI1、KPNA2的阳性表达

TNBC 癌组织中EVI1、KPNA2 表达位于细胞核或细胞质，阳性为淡黄色至棕色颗粒，见图1。

图1 EVI1、KPNA2在TNBC癌组织中的表达 （×400）

2.2 3组EVI1、KPNA2表达的比较

癌组织、癌旁组织和对照组EVI1、KPNA2 总的阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=30.717和40.855，均P=0.000）；进一步两两比较，癌组织中EVI1、KPNA2 阳性表达率高于癌旁组织和对照组（P<0.013），癌旁组织和对照组EVI1、KPNA2 阳性表达率比较，差异无统计学意义（P>0.013）。见表1。

表1 TNBC癌组织、癌旁组织和对照组EVI1、KPNA2阳性表达率的比较 例（%）

2.3 不同临床病理特征的TNBC 患者的EVI1、KPNA2表达比较

如表2所示，不同年龄、乳腺肿块直径、分化程度的TNBC 患者的EVI1 阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；不同组织学分级、淋巴结、Ki-67 表达、脉管内癌栓TNBC 患者的EVI1 阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中，组织学分级Ⅲ级的TNBC 患者EVI1 阳性率高于Ⅰ+Ⅱ级的患者，淋巴结为N1、N2的TNBC 患者EVI1 阳性率高于无淋巴结转移患者，Ki-67 高表达的TNBC 患者EVI1 阳性率高于低表达者，有脉管内癌栓的TNBC 患者EVI1阳性率高于无脉管内癌栓患者。不同年龄、乳腺肿块直径、分化程度、组织学分级、Ki-67 表达、脉管内癌栓的TNBC 患者的KPNA2 阳性表达率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；淋巴结是否转移的TNBC 患者的KPNA2 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.05），淋巴结N1、N2患者的KPNA2 阳性表达率高于无淋巴结转移患者。

表2 不同临床病理特征的TNBC患者的EVI1、KPNA2阳性率的比较

2.4 不同EVI1、KPNA2 表达TNBC 患者的生存率比较

所有患者均完成随访，随访时间最短60 个月，最长96 个月，中位随访时间82 个月。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，EVI1 阳性表达者PFS 生存率为35.56%（16/45），低于EVI1阴性表达者67.86%（19/28）（χ2=6.843，P=0.009），EVI1阳性表达者OS生存率为77.78%（35/45），低于EVI1阴性表达者96.43%（27/28）（χ2=4.688，P=0.031）。KPNA2 阳性表达者PFS 生存率为36.59%（15/41），低于KPNA2阴性表达者62.50%（20/32）（χ2=4.836，P=0.028），KPNA2阳性表达者OS生存率为75.61%（31/41），低于KPNA2阴性表达者的96.88%（31/32）（χ2=5.387，P=0.021）。见图2、3。

图2 不同EVI1、KPNA2表达TNBC患者的PFS生存曲线

图3 不同EVI1、KPNA2表达TNBC患者的OS生存曲线

3 讨论

乳腺癌是严重威胁女性健康和生命安全的恶性肿瘤，是全世界发病率最高的女性恶性肿瘤[7]。不同类型乳腺癌临床和分子生物学特征不同，治疗反应性、预后也不尽相同。TNBC 因异质性和缺乏治疗靶点，临床治疗效果差，是所有乳腺癌类型中预后最差的分子分型之一[8-9]，明确分子亚型和靶向抑制是阻止TNBC 恶性进展，提高患者生存率的关键和必要条件。探讨与TNBC 恶性进展相关的分子机制有助于完善临床治疗方法，为预后评估提供可靠信息。

EVI1 是癌基因转录因子，位于染色体3q26 上，包含2 个DNA 结合锌指结构域，一个结合GATA 样基序，另一个结合v-ets 红细胞增多症病毒E26 癌基因同源性样基序（E26 transformation-specific sequence,ETs）。EVI1 通过与C 末端结合域、cAMP 反应元件结合蛋白和p300/CBP 相关因子等转录调控因子相互作用调控靶基因表达[10]。EVI1 可抑制转化生长因子β 信号并激活Notch 信号促使造血干细胞向主动脉内皮细胞转化[11]。EVI1 在髓系白血病、多形性胶质母细胞瘤、幕下室管膜瘤等实体肿瘤中异常表达，EVI1 高度表达与较短生存期、肿瘤药物耐药有关，下调EVI1 表达能抑制肿瘤细胞生长[12-13]。本研究发现，EVI1 在TNBC 癌组织中阳性表达率高于癌旁组织和正常乳腺组织，提示EVI1 可能参与TNBC 发病机制。文献[14]指出EVI1 通过调控乳腺癌干细胞增殖过程参与乳腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化等过程，促进乳腺癌发生和恶性进展。本研究进一步分析不同临床病理特征的TNBC 患者的EVI1 表达发现，不同组织学分级、淋巴结、Ki-67表达、脉管内癌栓TNBC患者的EVI1阳性表达率比较，差异有统计学意义，即EVI1 表达越高，TNBC 组织学分级越高，Ki-67表达越高，发生淋巴结转移和脉管内癌栓的可能性越大，说明EVI1表达与TNBC恶性程度、侵袭转移有关，可能与EVI1诱导TNBC癌症干细胞过度活化有关，提示EVI1在TNBC发病机制中发挥致癌基因作用。Kaplan-Meier 生存曲线分析EVI1 阳性表达患者PFS生存率、OS生存率均低于EVI1阴性表达患者，说明EVI1阳性表达与TNBC不良预后有关。一项荟萃分析显示高EVI1表达与急性髓系白血病患者较短OS[H^R=1.73，95% CI：（1.43，2.11）]和无事件生存率[H^R=1.17，95% CI：（1.05，1.31）]相关[15]。本研究结果提示EVI1可作为TNBC恶性进展和不良预后的辅助诊断指标，抑制EVI1表达可能阻止TNBC恶性进展。

KPNA2 位于染色体17q23-q24，由N 端亲水性结构域、短C 端和中心区域组成，中心区域有2 个核定位信号结合位点，能够与具有特异性核定位信号的入核蛋白结合，对细胞功能相关mRNA 和转录因子进出细胞核提供空间定位作用，在细胞增殖、分化等生理过程中发挥重要作用[5]。KPNA2 还通过参与细胞分化、增殖、凋亡、免疫应答和病毒感染等促进肿瘤的形成和发展，在肝癌、胰腺癌、大肠癌等肿瘤中高度表达，与癌细胞增殖、迁移和不良预后有关[4，16-17]。KPNA2 作为miR-26a/b新靶点，通过雌激素/c-Myc/miR-26b 轴介导的雌激素刺激细胞生长而控制雌激素水平，促进乳腺癌细胞增殖[18]。KPNA2 在TNBC 的表达和作用机制尚不十分清楚，本研究发现KPNA2 在TNBC 癌组织中呈高度表达，阳性表达率达56.16%，高于癌旁组织和正常乳腺组织；淋巴结是否转移的TNBC 患者的KPNA2 阳性表达率比较，差异有统计学意义，可能与KPNA2 对关键核蛋白的异常定位导致癌细胞侵袭、增殖和转移有关。ALSHAREEDA[19]检测1 494例乳腺癌患者KPNA2 表达情况，发现KPNA2 在ER阴性和三阴性表型乳腺癌患者中表达明显升高，认为高KPNA2 表达与细胞质定位功能、核蛋白低表达有关。近期报道显示KPNA2 过度表达提高乳腺癌MCF-7 细胞侵袭和迁移能力，KpNa2 缺失可下调LoxL2、BMP6、ITGA6 等肿瘤转移相关基因表达，抑制肿瘤进展，KPNA2 在乳腺癌转移中具有重要作用[20]。本研究通过Kaplan-Meier 生存曲线分析发现KPNA2 阳性表达与TNBC 患者低PFS 生存率、低OS 生存率有关，ALSHAREEDA[19]在对乳腺癌患者长期随访中发现，KPNA2 高表达乳腺癌患者无病生存率偏低，AL-KAABI 等[21]指出KPNA2 高表达与接受环磷酰胺、甲氨蝶呤和氟尿嘧啶化疗的ER 阴性和TNBC 患者较短生存期有关。

综上所述，TNBC 患者EVI1、KPNA2 均呈高表达，其阳性表达与TNBC 患者恶性侵袭行为和不良预后有关，可以作为TNBC 患者病情评估和预后预测的辅助指标。鉴于EVI1、KPNA2 在TNBC 疾病进展中的作用，抑制EVI1、KPNA2 表达可能成为临床治疗TNBC 新的靶点和方向。