复方拜颤停片5 种成分在帕金森病模型大鼠体内组织分布特征研究

卢芳，张冶，白宛鑫，卢意，吴娟，刘树民

1.黑龙江中医药大学继续教育学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学研究生院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学药物安全性评价中心，黑龙江 哈尔滨 150040；4.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一种多发于老年人的神经退行性疾病，主要表现为静止性震颤、肌肉僵直等，中晚期患者甚至出现神经错乱等临床症状，严重影响患者的生活质量。研究认为，PD主要由中脑黑质中多巴胺能神经元丢失，黑质内出现路易小体，α 突触蛋白表达量增加所致[1]。由于PD病因复杂、机制尚未阐明，目前尚无特效药物。

拜颤停复方为黑龙江中医药大学刘树民教授临床治疗PD 经验方复元平颤宁精简而成，由刺五加、白芍、钩藤的有效部位提取物组方。本课题组前期研究显示，拜颤停复方能增加PD 模型小鼠纹状体内多巴胺含量[2]，改善PD 模型小鼠行为学变化，且具有抗炎、抗氧化及清除自由基等作用[3-4]，并优化得到组方药物的最佳配伍比例及片剂处方[2，5]。药物口服入体后，活性成分经循环系统到达组织器官，其组织分布特征不仅与药物本身的理化性质有关，还与药物和组织的亲和力有密切关系。笔者在查阅相关文献[6-11]基础上，以刺五加主要有效成分异嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E，白芍主要有效成分芍药苷，以及钩藤主要有效成分异钩藤碱，作为复方拜颤停片的代表性成分，利用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）研究5种成分在PD模型大鼠体内各脏器的分布特征，为复方拜颤停片的后续研究提供依据。

1 仪器、试药与动物

API4000 液质联用仪（美国Waters 公司），配有电喷雾离子源（ESI），分析软件MassLynx4.0；Acquity TH UPLC 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（美国Waters 公司）；KDC-160HR 高速冷冻型离心机（科大创新有限公司）；WHL 微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；ME235S 电子分析天平（德国Sartourious公司）；MTN-2800 氮吹仪（Auto Science 公司）。

对照品紫丁香苷（批号110873-201012，纯度94.9%）、异嗪皮啶（批号110673-201105，纯度99.2%）、刺五加苷E（批号110736-201006，纯度98.1%）、芍药苷（批号110482-201009，纯度97.4%）、异钩藤碱（批号110284-201102，纯度98.4%）、葛根素（批号110752-201012，纯度95.5%），中国食品药品检定研究院。复方拜颤停片，本课题组联合世一堂制药厂制备，批号1905307，片重0.4 g，含异嗪皮啶0.20%、紫丁香苷0.66%、刺五加苷E 0.13%、芍药苷7.08%、异钩藤碱0.52%。甲醇（色谱级，美国Fisher 公司），乙腈（色谱级，美国Fisher 公司），甲酸（色谱级，美国ROE Scientific 公司），1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP，上海德默医药科技有限公司，批号20141019，规格100 mg），水为娃哈哈纯净水。

SD 雄性大鼠36 只，SPF 级，体质量（200±20）g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（黑）2019-0001，于屏障环境动物室内标准条件饲养，适应性饲养1 周后开始实验。

2 方法与结果

2.1 动物给药与样本采集

大鼠腹腔注射MPTP（30 mg/mL），连续7 d，制作PD 模型[12]，以四肢僵直、竖毛、爬杆时间延长、自主活动减少为成模标准。随机取30 只成模大鼠，灌胃给予复方拜颤停片926 mg/kg（根据预实验结果确定）。给药前禁食过夜，自由饮水。分别于给药后1、6、8、10、24 h 随机取6 只大鼠处死，摘取肝、心、脾、肺、肾、小肠及脑组织，用生理盐水洗去残血，滤纸吸干后称定质量。取各组织0.5 g，按组织∶生理盐水＝1∶2（g∶mL）加入生理盐水，手动匀浆，得到组织匀浆样品，-80 ℃冰箱保存，备用。

2.2 样品前处理

组织匀浆样品室温融化，15 000 r/min 离心10 min，取上清液适量，加入乙腈沉淀蛋白，15 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，于氮吹仪下37 ℃吹干，残渣用等体积乙腈复溶，涡旋10 min，4 ℃、15 000 r/min离心10 min，取上清液适量，进行UPLC-MS 分析。

2.3 工作液配制

分别精密称取紫丁香苷、异嗪皮啶、刺五加苷E、芍药苷、异钩藤碱对照品各1 mg，用甲醇溶解，制成浓度均为0.1mg/mL的对照品溶液，4℃冰箱保存备用。分别精密移取上述对照品溶液50μL，用甲醇配制成浓度均为5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039μg/mL的系列混合对照品溶液，4℃冰箱保存备用。

精密称取葛根素对照品0.39mg，用甲醇溶解，制成7.8μg/mL 的葛根素标准工作液，作为内标溶液，4℃冰箱保存备用。

2.4 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLCBEH C18（2.1mm×50mm，1.7μm），柱温为室温（22～24℃），流速0.3mL/min，以甲醇（A）和0.1%甲酸-水（B）为流动相，梯度洗脱（0～2min，0%～20%A；2～10 min，20%～80%A；10～12min，80%～20%A）。

2.5 质谱条件

采用ESI；芍药苷用负离子检测，其余成分均用正离子检测；扫描方式为多反应监测模式（MRM）；喷雾电压4500V，金属毛细管压力3kV，锥孔电压50V，离子源温度100℃，脱溶剂气流量800L/h，锥孔气流量80L/h。用于定量分析的离子对：异嗪皮啶m/z223→162，紫丁香苷m/z 395→232，刺五加苷E m/z 765→603，芍药苷m/z525→449，异钩藤碱m/z385→160，葛根素m/z 417→267。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性考察

取空白组织样品、空白组织样品＋对照品＋内标、给药1h组织样品＋内标，按“2.2”项下方法处理，按“2.4”“2.5”项下条件进样检测。脑组织样品检测结果见图1。空白脑组织样品＋对照品＋内标溶液中异嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍药苷、异钩藤碱、葛根素（内标）的保留时间分别为4.14、2.79、4.32、3.74、4.46、3.56min，给药1h 脑组织样品上述各成分的保留时间分别为4.23、2.88、4.37、3.79、4.64、3.60 min。可以看出，组织中内源性物质不干扰目标成分的测定。

图1 PD模型大鼠脑组织中5种成分提取离子流图

2.6.2 标准曲线和定量限

分别精密吸取PD 模型大鼠肝、心、脾、肺、肾、脑、小肠组织匀浆样品100 μL，加入“2.3”项下系列混合对照品溶液100 μL，再加入100 μL 内标溶液，按“2.2”项下方法处理，按“2.4”“2.5”项下条件进样分析，各成分标准曲线回归方程见表1。在测定的浓度范围内，各目标成分在各组织中的线性关系均良好。各目标成分的线性范围均为13～1667 ng/mL，定量限均为13 ng。

表1 PD 模型大鼠各组织中5 种成分线性关系考察结果

2.6.3 提取回收率与基质效应

分别精密吸取 PD 模型大鼠脑组织匀浆样品100 μL，依次加入低、中、高浓度混合对照品溶液100 μL，再加入100 μL 内标溶液，按“2.2”项下方法处理后进样分析，得到响应值A；取脑组织样品，按“2.2”项下方法处理，再加入混合对照品溶液和内标溶液，进样分析，得到响应值B；取溶剂为乙腈的对照品溶液进样分析，得到响应值C。同时测定5 个平行样品，计算提取回收率（A/B×100%）和基质效应（B/C×100%）。在脑组织样品中，各目标成分在低、中、高浓度下的提取回收率及基质效应见表2。在其他组织（心、肝、脾、肺、肾、小肠）样品中，各目标成分在不同浓度下的的提取回收率及基质效应为80%～105%，RSD 均小于15%，表明各目标成分在各组织中提取回收率高，重复性好，且各组织对目标成分无基质效应干扰，不影响该方法的准确性与重现性。

表2 PD 模型大鼠脑组织中5 种成分提取回收率和基质效应（%，n＝5）

2.6.4 精密度试验

分别精密吸取PD 模型大鼠脑组织样品100 μL，依次加入低、中、高浓度的混合对照品溶液100 μL，分别按“2.2”项下方法处理，按“2.4”“2.5”项下条件进样分析，每一浓度5 个平行样品，连续测定3 d。大鼠脑组织样品中，各目标成分在低、中、高浓度下日内精密度及日间精密度的相对标准偏差（RSD）、相对误差（RE）均在±15%之内，见表3。在其他组织（心、肝、脾、肺、肾、小肠）样品中，各目标成分在不同浓度的日内精密度及日间精密度RSD、RE均在±15%之内，表明精密度良好。

2.6.5 稳定性试验

按“2.3”项下方法制备低、中、高浓度质控样品，考察室温放置4 h（短期稳定性）、-20 ℃存放4 周（长期稳定性）、在自动进样器中室温放置12 h（制备后稳定性）、-20 ℃取出后于室温融化并反复冻融3 次（冻融稳定性）的回收率和RSD，脑组织样品中5种成分的稳定性试验结果见表4。在其他组织（心、肝、脾、肺、肾、小肠）样品中，不同浓度质控样品在上述4 种环境中的回收率RSD 为1.79%～9.04%。结果表明，在各组织（心、肝、脾、肺、肾、小肠、脑）中，5 种目标成分在各种条件下的稳定性均良好。

2.7 组织分布试验

PD 模型大鼠给药后各成分在不同时间点的组织分布浓度见表5。可以看出，给药后6 h 各成分的组织分布浓度最高，分别于1、8 h 在小肠中出现2 个高峰。除小肠外，给药后6 h，大鼠体内异嗪皮啶的组织分布为肾＞脾＞心＞肝＞脑＞肺，紫丁香苷为肾＞脑＞肺＞脾＞肝＞心，刺五加苷E 为肾＞脾＞脑＞肺＞心＞肝，芍药苷为肾＞肝＞脾＞心＞脑＞肺，异钩藤碱为肾＞肝＞脾＞心＞脑＞肺。

表3 PD 模型大鼠脑组织中5 种成分精密度试验结果（n＝5）

表4 PD 模型大鼠脑组织中5 种成分稳定性试验（%，n＝5）

表5 PD 模型大鼠给药后不同时间5 种成分组织分布浓度（，μg/mL，n＝6）

表5 PD 模型大鼠给药后不同时间5 种成分组织分布浓度（，μg/mL，n＝6）

3 讨论

药物在机体组织中的分布特征是药代动力学的主要研究内容之一，通过了解药物的组织分布情况，可进一步明确其作用靶点，为新药安全性评价等奠定基础[13]。PD 属中医学“颤证”范畴，其病机多为脾之化源不足，肝肾亏虚，导致筋脉拘挛、虚风内动，治疗以补益肝肾为主[14-15]。在复方拜颤停片中，白芍代表成分芍药苷和钩藤代表成分异钩藤碱均在肝、肾中浓度较高，刺五加代表成分异嗪皮啶、刺五加苷E和紫丁香苷均在肾、脾中浓度较高，可见，刺五加、白芍、钩藤三药配伍可协同调理肝、肾、脾三脏，达到熄风止颤目的。

本研究建立了UPLC-MS 测定大鼠肝、心、脾、肺、肾、脑及小肠组织中复方拜颤停片有效成分异嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、异钩藤碱和芍药苷含量的方法，具有准确性、专属性。给药后目标成分在PD 模型大鼠体内组织分布情况显示，各成分在小肠中分别于1、8 h 出现2 个高峰，测定时间内在肝与小肠中的变化趋势相反，推测可能存在肝肠循环。此外，异嗪皮啶、紫丁香苷、刺五加苷E、芍药苷和异钩藤碱均在肾脏中含量最高，可能由于这5 种成分均主要通过肾脏代谢。

PD 主要由于多巴胺能神经元损伤，纹状体内多巴胺浓度下降，进而引起大脑兴奋和抑制的神经反馈调节失衡[16]。本研究结果显示，在脑组织中，紫丁香苷与芍药苷分布浓度较高，刺五加苷E、异嗪皮啶和异钩藤碱也有不同程度分布，表明这5 种成分均能通过血脑屏障，作用于脑，进而发挥其治疗作用。刺五加归脾、肾、心经，白芍归肝、脾经，钩藤归肝、心包经，本研究结果与药物归经不完全一致，可能由于中药具有多成分、多靶点的特性，某个药物单体成分并不能完全显示该药的归经，且药物配伍也可能影响其归经。

综上，本研究对复方拜颤停片在PD 模型大鼠体内的组织分布情况进行研究，可为其药效物质基础研究及新药开发提供重要依据。