基于网络药理学的辛夷治疗过敏性鼻炎作用机制研究

周毅叶 ，王祺，贾妍卓，梁玉琳，王堯，王雨琪，邹俊波，2，史亚军，2，张小飞，2

1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学药学院陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046

辛夷又称望春花，为武当玉兰或玉兰的干燥花蕾，始载于《神农本草经》。辛夷能温中解肌，善于通透九窍，尤善通鼻窍，对鼻炎、头痛、鼻塞、齿疼等有良好的治疗作用。辛夷外可祛风除寒，内可升达肺胃清气。现代药理研究表明，辛夷挥发油可收缩鼻黏膜血管，促进黏膜分泌物吸收，进而保护鼻黏膜，减轻鼻腔炎症，有局部抗过敏、收敛、刺激和麻醉、抑菌、抗炎作用[1-2]。

过敏性鼻炎属中医学“鼻鼽”范畴，临床表现为鼻痒、喷嚏、流清涕、鼻塞等。辛夷为治疗过敏性鼻炎常用药，其作用机制尚不明确，药效成分和核心靶点蛋白有待探究。本研究应用网络药理学方法，通过筛选辛夷活性成分作用靶点和疾病靶点，建立药物-靶点-疾病网络，探讨辛夷治疗过敏性鼻炎的作用机制，为其药理研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 辛夷活性成分筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），在“Herb name”词条框中输入“辛夷”，获取辛夷条目，点击进入并获取分子信息，包括活性成分的分子名称（molecule name）、口服生物利用度（OB）、相对分子质量（MW）、类药性（DL）等。以OB≥30%和DL≥0.18 作为条件筛选辛夷的活性成分。

1.2 辛夷活性成分相关蛋白靶点获取

根据筛选得到的活性成分，在TCMSP 中点击“Related Targets”，获取成分的“Targets Information”，得到该成分作用的靶蛋白名（target name）。在Uniprot（http://www.uniprot.org/）中，使用Uniprot KB 检索功能，在检索框中输入靶蛋白名，检索条件为“organism：homo sapiens”和“reviewed：yes”，获取基因名（gene name）和Uniprot ID。检索结果以.exe格式导出，保留不同成分作用蛋白靶点基因条目，包括辛夷活性成分对应人类的相关蛋白靶点基因及其对应Uniprot ID。

1.3 辛夷成分-靶点网络构建

将辛夷活性成分和相关作用靶点导入Cytoscape3.7.1 软件，构建成分-靶点网络，使成分-靶点关系可视化，并进行网络拓扑学分析，以自由度（degree）为筛选参数，进行化合物成分和蛋白靶点的筛选。在该网络中，活性成分与蛋白靶点均由节点（node）表示，二者的作用关系用边（edge）表示，最终得到成分-靶点网络图。

1.4 过敏性鼻炎相关靶点基因获取

通过TTD（https://db.idrblab.org/ttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeneT/menu/home ）、OMIM（http://www.omim.org/）数据库，以“allergic rhinitis”为关键词检索过敏性鼻炎相关基因，分别获取过敏性鼻炎相关基因和蛋白靶点信息，对数据进行整理合并，并删除重复值（相同的Gene 简称），得到包括基因、对应靶点名称（target name）和UN 结果（Uniprot）的Excel 文件。

1.5 辛夷活性成分靶点与过敏性鼻炎疾病靶点交集数据获取

建立辛夷活性成分靶蛋白的Excel 文件，包括分子名称（molecule name）、成分编号（RST ID 自定义）、基因名（gene names）和Uniprot ID（Entry ID，单一基因的标准化，Uniprot 数据库中的唯一编号）和蛋白名（protein names）。建立过敏性鼻炎相关靶蛋白的Excel 文件，包括蛋白名（protein names）、基因名（gene names）和Uniprot ID（Entry ID）。对过敏性鼻炎疾病靶点与辛夷活性成分靶点运用Excel 筛选功能，以“gene names”为查询条件，映射出每个活性成分与过敏性鼻炎相关靶蛋白的交集，获得辛夷活性成分靶蛋白与过敏性鼻炎靶蛋白交集的关键靶点，包括蛋白名、基因名和Uniprot ID。

1.6 交集蛋白靶点相互作用网络构建

检索String 数据库（https://string-db.org/），点击“Multiple Proteins”，在“List Of Names”词条框中输入交集靶点，并在“Organism”词条框中选择“Homo sapiens”，点击“SEARCH”，点击“CONTINUE”，获取交集蛋白靶点的相互作用关系，保存文件并导入Cytoscape3.7.1 软件，绘制交集靶点网络图，以自由度（degree）为筛选参数，进一步调节，使交集蛋白靶点之间的关系更为明确。

1.7 交集靶点生物过程和KEGG 通路富集分析

运用R 语言clusterProfiler 包对辛夷活性成分治疗过敏性鼻炎靶点进行GO 分析，获取其生物过程（biological process，BP），并进行KEGG 通路富集分析。

1.8 分子对接

为进一步验证活性成分与蛋白靶点之间的结合活性，利用Discovery Studio 4.0 软件，将前5 个靶蛋白与其对应的药物活性成分进行分子对接，并对结果进行分析。在DrugBank（https://www.drugbank.ca/）中得到靶蛋白对应的阳性药，从蛋白数据库PDB（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中搜索并下载靶蛋白及阳性药三维结构，作为分子对接的载体。从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索并下载配体的.sdf 格式文件，用于与蛋白质、阳性药结构的分子对接。利用Discovery Studio 4.0 的Clean Protein 工具对蛋白结构进行以下操作：删除配体分子和水分子、不全不完整残基、多余蛋白质构象，并加氢和分配相关电荷。利用LibDock 工具，Comformation Method 参数设置为“BEST”，Docking Preferences 参数设置为“High Quality”，其余参数为默认，记录配体在此口袋的打分值LibDock Score。

2 结果

2.1 辛夷活性成分

通过TCMSP 检索到184 个辛夷化合物，筛选出19 个活性化合物，见表1。

2.2 辛夷活性成分对应靶蛋白

通过TCMSP分别获取19个成分作用的相关靶点蛋白名称，通过PubChem 数据库Search PubChem 检索得到对应Canonical SMILES，再用SwissTargetPrediction数据库检索Predict targets，得到药物作用的相关靶点蛋白名称，合并后共获取928 条靶点信息。

表1 辛夷活性化合物基本信息

2.3 辛夷活性成分-靶点网络

药物活性成分-靶点网络由431 个节点组成，包括18 个药物成分节点和413 个蛋白靶点节点，自由度最大为116，最小为1，平均自由度4.292，以大于平均自由度为条件筛选核心靶点网络，见图1。主要活性成分（自由度）包括异二氢氟喹诺酮A（116）、加尔加拉文（113）、鹅掌楸树脂酚B 二甲醚（108）、去核剂a（105）、去甲槟榔碱（104）等。

图1 辛夷核心成分-靶点网络

2.4 过敏性鼻炎相关靶点

从TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM 数据库中分别获取到27、10、163、266 条疾病相关靶点，去重后得到336 条过敏性鼻炎相关基因靶点信息。

2.5 辛夷成分靶点与过敏性鼻炎疾病靶点交集分析

辛夷成分靶点（353 个）与过敏性鼻炎疾病靶点（283 个）取交集，得到43 个靶点基因，分别为PTGS2、ADRB2、ALOX5、GABRA2、PIK3CG、PIK3CA、PIK3CD、PIK3CB、NR3C1、TBXA2R、PTGER3、HIF1A、KNG1、PTGS1、MMP9、GSTP1、ADRA2C、CHRM2、CHRM3、ADAM10、TSPO、PDE5A、HRH3、HRH4、IRAK4、PDE4D、PRKCQ、CCR4、ADORA2A、TLR9、TGFBR1、PLA2G7、IDO1、PLAT、CNR1、CNR2、PRKCG、ICAM1、SERPINE1、CFTR、CCR5、FABP4 和C5AR1。

2.6 交集蛋白靶点相互作用网络

利用String 获取交集蛋白靶点网络，包含40 个节点（3 个靶点未参与）、149 条边，平均自由度为6.93，平均局部聚类系数为0.673，见图2。

2.7 成分-靶点-疾病网络

辛夷治疗过敏性鼻炎成分-靶点-疾病网络由60个节点组成，包含17 个药物成分节点和43 个蛋白靶点节点，见图3。该网络最大自由度为16，平均自由度为4.1。取大于平均自由度的节点作为辛夷治疗过敏性鼻炎成分-靶点-疾病核心网络，包含8 个成分节点和6 个蛋白靶点节点，见图4。8 个成分（自由度）分别为鹅掌楸树脂酚B 二甲醚（16）、加尔加拉文（16）、异二氢氟喹诺酮A（16）、去核剂a（14）、亚油酸乙酯（13）、去甲槟榔碱（13）、(-)-白玉兰亭B（11）山蒟酮（10）。6 个蛋白靶点分别为前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、前列腺素G/H 合成酶1（PTGS1）、PI3 激酶p110α 亚单位（PIK3CA）、花生四烯酸盐5-脂氧合酶（ALOX5）、前列腺素EP3 受体（PTGER3）、毒蕈碱乙酰胆碱受体M3（CHRM3），其自由度分别为15、7、6、6、5、5。

图2 辛夷治疗过敏性鼻炎交集蛋白靶点相互作用网络

图3 辛夷治疗过敏性鼻炎成分-靶点-疾病网络

图4 辛夷治疗过敏性鼻炎成分-靶点-疾病核心网络

2.8 生物过程和KEGG通路富集分析

GO富集分析得到613条生物过程，核心生物过程见图5。可以看出，辛夷治疗过敏性鼻炎与5条生物过程紧密相关，分别为炎症反应的调节、白细胞迁移、体液水平调节、对外界刺激反应的积极调节、对细菌来源分子的反应。KEGG 通路富集分析得到95条调控通路，核心通路见图6。可以看出，辛夷治疗过敏性鼻炎与5条通路紧密相关，分别为刺激神经组织中的交互、胆碱能突触、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、趋化因子信号通路。

2.9 分子对接分析

选择成分-靶点-疾病核心网络中自由度居前5位的蛋白靶点，与其对应化合物进行分子对接，采取刚性对接，利用Discovery Studio4.0软件进行阳性药验证，结果见表2、表3，相互作用关系见图7～图11。

图5 辛夷治疗过敏性鼻炎BP富集分析

图6 辛夷治疗过敏性鼻炎KEGG 通路富集分析

表2 辛夷治疗过敏性鼻炎核心靶点与化合物结合活性得分

表3 辛夷治疗过敏性鼻炎核心靶点与化合物、阳性药结合活性得分比较

图7 ALOX5与XY-14 相互作用关系图

图8 PTGER3与XY-01相互作用关系图

图9 PTGS1与XY-19 相互作用关系图

图10 PTGS2与XY-12相互作用关系图

图11 PIK3CA 与XY-01相互作用关系图

3 讨论

过敏性鼻炎常为基因、空气环境因素，或两者共同作用所导致，主要为尘、螨、花粉等[3-4]吸入性变应原侵袭鼻腔，并诱导特异性IgE 抗体与之反应而发病。近年来，随着环境条件的改变，空气环境成为过敏性鼻炎的主要致病因素[5]。中医认为，该病发生与外感风寒、脏腑功能失调或邪气入侵鼻窍有关，并根据临床表现将其分为肾阳亏虚型、气虚寒型、气虚血瘀型、外寒内热型等。临床需辨明寒热和脏腑病位及其病机，根据不同证型，可采用温阳补肾法[6]、温肺散寒法[7]、补中益气法[8]、活血化瘀法[9]、平调寒热法[10]治疗。辛夷善通鼻窍，故在过敏性鼻炎各证型的治疗中多有使用。

本研究通过对辛夷主要活性成分的作用靶点进行筛选，并与过敏性鼻炎的疾病相关靶点取交集，筛选出辛夷治疗过敏性鼻炎的活性成分-靶点-疾病网络，对网络中的核心靶点进行生物过程和信号通路分析。结果表明，辛夷治疗过敏性鼻炎的主要活性成分为鹅掌楸树脂酚B二甲醚、加尔加拉文、亚油酸乙酯等，PTGS2、PTGS1、PIK3CA、ALOX5、PTGER3等靶点是白细胞迁移、炎症反应的调节、体液水平调节、对细菌来源分子的反应、对外界刺激反应的积极调节等生物过程的核心靶点。汤雁利等[11]研究康复新药物的抗炎作用及其机制，结果表明康复新可抑制巨噬细胞的炎症作用，是通过降低PTGS2基因的表达而抑制炎症反应，进一步表明PTGS2与炎症反应密切相关。廖世峨等[12]研究ALOX5与儿童哮喘易感性的关系，结果显示ALOX5与哮喘的严重程度、过敏、肺功能指标等有关。同时，过敏性鼻炎可诱导哮喘，ALOX5基因与其易感性也存在密切关系[13]，表明ALOX5对过敏性鼻炎的易感性与过敏性有重要作用。胆碱能突触、刺激神经组织中的交互、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、趋化因子信号通路等为辛夷治疗过敏性鼻炎的主要信号通路。范隽等[14]研究HIF-1信号通路对鼻炎发病机制的影响，表明HIF-1信号通路与鼻腔内的钩突黏膜组织密切相关。李影等[15]对肿瘤坏死因子参与炎症反应免疫调节的研究指出，肿瘤坏死因子直接或间接募集并激活活化转录因子信号通路，诱导免疫反应和炎症反应，从而参与炎症性疾病。祁建妮[16]对microRNA-210调节炎症反应的研究表明，固有免疫中的巨噬细胞识别细胞膜表面的模式识别受体，进而识别细菌和病毒，经过一系列信号转化激活转录因子，转录因子与抗体结合后产生大量促炎因子、趋化因子，同时，促炎因子和趋化因子具有清除微生物感染的作用。另外，辛夷参与的体液水平调节、对外界刺激反应的积极调节的生物过程是治疗过敏性鼻炎体内调节的主要过程。

本研究表明，辛夷活性成分可通过参与炎症反应的调节、白细胞迁移、体液水平调节、对外界刺激反应的积极调节、对细菌来源分子的反应等生物过程，以及刺激神经组织中的交互、胆碱能突触、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、趋化因子信号通路等生物通路发挥治疗过敏性鼻炎作用。辛夷活性成分具有良好的抗组胺、抑制炎症反应和促进免疫调节的作用，通过多靶点与多成分的协同作用，达到治疗过敏性鼻炎的效果。本研究可为过敏性鼻炎治疗药物的实验和临床研究提供依据。