钩藤总碱的热稳定性研究

刘 卫,杨雪萍,王中师，,王 盟,张 强,郝立勇

(1.解放军第88医院药剂科，山东 泰安 271000；2.泰山医学院药学院，山东 泰安 271000)

钩藤总碱的热稳定性研究

刘 卫1,杨雪萍1,王中师1，2,王 盟1,张 强1,郝立勇2

(1.解放军第88医院药剂科，山东 泰安 271000；2.泰山医学院药学院，山东 泰安 271000)

目的考察钩藤总碱的热稳定性。方法在不同温度条件下，用高效液相色谱检查钩藤总碱中的钩藤碱和异钩藤碱。结果与钩藤碱相比，异钩藤碱溶液对热不稳定，60 ℃或90 ℃ 2 h后异钩藤碱含量明显降低，而钩藤碱溶液在60 ℃ 2 h或4 ℃ 6 d的环境中稳定。而且，钩藤碱和异钩藤碱成盐后更加稳定。结论异钩藤碱的热不稳定性是钩藤“后下”的原因。

钩藤碱；异钩藤碱；钩藤总碱

天麻钩藤饮出自《杂病证治新义》，具有平肝潜阳、补益肝肾、清热活血的作用，是中医治疗肝阳上亢型高血压的经典方。钩藤是天麻钩藤饮中的君药，在煎药时要求“后下”，即“候他药煎就，方入钩藤”[1]，避免久煎。为此，作者考察了温度对钩藤主要有效成分钩藤总碱的影响，以期为钩藤总碱的制剂研究提供参考。

1 材料和方法

1.1药品和仪器 钩藤，购自广西。经泰山医学院药学系鉴定为钩藤Uncariarhynchophylla(Miq) Jacks，按文献[2]方法用钩藤提取总碱。钩藤碱、异钩藤碱对照品，购自中国药品生物制品检定所。高效液相色谱仪，Agilent 1200，Hypersil C1825 cm×4.6 mm色谱柱。

1.2实验方法 钩藤总碱的含量测定:精密称取钩藤提取物50 mg加氯仿使溶解，精确加入25 ml 0.01 mol/L硫酸标准液，在水浴上挥去氯仿，用滤纸过滤，瓶中残渣用适量蒸馏水洗涤2次，过滤，合并滤液和洗液，加入甲基红-亚甲蓝混合指示剂2滴，以0.02 mol/L氢氧化钠溶液滴定，由樱红色至黄绿色为终点。总碱量以钩藤碱计，每1 ml 0.01 mol/L硫酸溶液相当于7.68 mg 钩藤碱。

钩藤碱、异钩藤碱的含量测定:用高效液相色谱法，流动相:甲醇-水(60:40 )含10 mmol/L 三乙胺，HAc调pH=7.5；流速：1 ml/min；测定波长：254 nm；在所拟色谱条件下，钩藤碱的理论塔板数不低于1 500。精密称取钩藤碱或异钩藤碱对照品5 mg，置于25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。分别取对照品溶液1.2、2.0、2.8、3.6、4.4 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下，进样20 μl，进行HPLC分析。以进样量X(μg)为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线。

A(钩藤碱)=11.132X-1.232，r=0.999 8

A(异钩藤碱)=21.243X-2.081，r=0.999 1

根据此标准曲线(线性范围0.48～1.76 μg)取钩藤提取物20 mg，用甲醇溶解后滤过，25 ml定容，进样量20 μl。测定钩藤提取物中钩藤碱和异钩藤碱的含量。

2 数据处理

所测含量以样品质量占提取物质量的百分数表示。单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett-t检验，比较不同温度对提取物各成分含量的影响。

3 实验结果

3.1钩藤碱和异钩藤碱的加样回收率 精密称取钩藤提取物约100 mg，甲醇溶解，置100 ml容量瓶中，加入或不加入钩藤碱或异钩藤碱对照品溶液20 ml, 稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜加压滤过，进样，测定钩藤碱或异钩藤碱峰面积，去除提取物本底中相应的峰面积，计算钩藤碱或异钩藤碱含量，连续测定6次，钩藤碱和异钩藤碱的平均回收率分别为(98.2±2.1)%和(96.1±2.5)% (n=6)。

3.2钩藤总碱的一般性质 按文献方法提取得到钩藤总碱，共3批，所得钩藤总碱不溶于水，溶于甲醇、氯仿，溶于聚乙二醇400，在给定的色谱条件下，HPLC性质见图1。

精密称取钩藤提取物约100 mg，甲醇溶解，置100 ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜加压滤过，测定钩藤总碱、钩藤碱和异钩藤碱含量，结果见表1。

3.3温度对钩藤总碱稳定性的影响 精密称取钩藤提取物适量，置水中制成混悬液，分别在60 ℃和90 ℃水浴中加热60 min，放冷至室温，用氯仿萃取，水浴蒸干，甲醇溶解，测定钩藤总碱、钩藤碱和异钩藤碱的含量，结果见表1。

图1 钩藤提取物(A)与对照品(B)色谱图

1-钩藤碱；2-异钩藤碱

3.4钩藤碱和异钩藤碱稳定性的比较 钩藤总碱的主要成分钩藤碱和异钩藤碱是同分异构体，有报道称在酸化和加热条件下可相互转化。笔者观察了贮存时间、温度和酸碱度对钩藤碱和异钩藤碱稳定性的影响。

3.4.1贮存时间的影响 分别取钩藤碱对照品4.4 mg或异钩藤碱对照品4.2 mg，用50 ml甲醇溶解，流动相甲醇-水改为80:20，含10 mmol/L 三乙胺，HAc调pH 至 7.5；进样10 μl。冷藏4 ℃ 6 d后再次进样见图2。结果表明，钩藤碱没有新的杂质生成，而异钩藤碱原有杂质含量增加，表明在给定的贮存条件下，钩藤碱比较稳定。

3.4.2温度的影响 分别取钩藤碱对照品4.4 mg或异钩藤碱对照品4.2 mg，用50 ml甲醇溶解，流动相甲醇-水(80:20)，含10 mmol/L 三乙胺，HAc调pH 至 7.5；进样10 μl。置60 ℃水浴2 h后再次进样，结果见图2。结果表明，钩藤碱没有新的杂质生成，而异钩藤碱原有杂质含量增加，表明在给定的温度作用下，钩藤碱比较稳定。

3.4.3酸碱度的影响 取钩藤碱对照品4.4 mg和异钩藤碱对照品4.2 mg，混合，用甲醇溶解，分别直接稀释或用氨水或醋酸调pH至9.0、7.5或4.0，25ml定容，流动相甲醇-水(80:20)，含10 mmol/L 三乙胺，HAc调pH 至 7.5；进样10 μl，结果见图3。将pH9.0、pH7.5和pH4.0的稀释液冷藏4 ℃ 6 d后调pH7.5再次进样，结果见图3。结果表明，pH4.0的稀释液中钩藤碱和异钩藤碱都稳定，但pH7.5、pH9.0的稀释液中杂质含量增加。

图2 温度对钩藤碱(A)和异钩藤碱(B)影响的色谱图

图3 酸碱度对钩藤碱和异钩藤碱混合物影响的色谱图

A-pH4.0；B-pH7.5；C-pH9.0；D-pH4.0， 6d后调pH7.5；E-pH7.5， 6d后；1- 钩藤碱；2-异钩藤碱

4 讨论

钩藤的药理作用包括降压、镇静、抗惊厥等[3]，在天麻钩藤饮和羚角钩藤汤等成方中都作为君药使用。由于其有效成分性质不稳定，在使用时有特殊要求，如天麻钩藤饮要求钩藤“后下”[1]，钩藤茶要求即冲即饮等。相关研究也多有报道，早在上世纪50年代，有文献指出[4]钩藤煎煮20 min其降压有效成分就有部分破坏，导致其降压作用减弱。钩藤中的生物碱是钩藤降压的主要有效成分，其作用强度顺序是异钩藤碱>钩藤碱>钩藤总碱[5]，可见，异钩藤碱和钩藤碱的稳定性是决定其降压作用的主要因素。钩藤碱和异钩藤碱占钩藤总碱的含量分别为28.9%和14.7%[6]，用目前的提取方法[2]得到的主要有效成分(表1)约为实际含量的一半。钩藤碱和异钩藤碱是同分异构体，在一定条件下可相互转化，例如，在煎煮过程中酸化可使异钩藤碱可转化为钩藤碱[7]，也有报道认为煎煮过程中有新的成分产生[8]。这些成分的不稳定性可导致钩藤药理作用的变化，掌握其变化规律对指导钩藤制剂的研究有实际意义。

温度对钩藤总碱稳定性的实验结果表明，加热对钩藤总碱和钩藤碱的影响并不显著，但异钩藤碱随温度升高导致含量明显降低，说明异钩藤碱在加热条件下分解或转化为其他碱性成分。从钩藤碱与异钩藤碱稳定性的比较实验中可以看出，在相同的贮存条件下，钩藤碱相对稳定，异钩藤碱随贮存时间延长和温度升高，其高效液相图谱中有两个杂质峰出现(图2 B1、B2、B3)，其中一个保留时间的位置与钩藤碱的位置相同，这与文献报道一致[7]。这些结果表明，钩藤总碱对热的确不稳定，钩藤碱与异钩藤碱相比，后者更不稳定，提示制剂研究时需考虑将总碱和钩藤碱作为定量指标。值得指出的是，在4 ℃相同贮存条件下，酸性条件下(pH4)钩藤碱和异钩藤碱混合物的稳定性优于碱性环境(图3)，提示钩藤碱和异钩藤碱成盐后较稳定。

[1] 吴仪洛. 本草从新[M]. 上海: 上海科技出版社, 1958: 135.

[2] 王 盟, 刘 卫, 邱庆浩, 等. 正交实验法优选钩藤总碱提取工艺[J]. 医药导报，2009, 28(9): 1200.

[3] 何 昱, 洪筱坤, 王智华. 钩藤及其有效成分的药理研究进展[J]. 上海中医药杂志, 2003, 37(11): 57.

[4] 郭协壎，顾雨时.钩藤的降低血压作用(煎法及其降压有效量的测定)[J].上海中医药杂志, 1959, 1: 46.

[5] 王 盟, 刘 卫. 钩藤总生物碱的研究进展[J]. 实用医药杂志, 2008, 25 (3): 361.

[6] 王瑞俭, 孙广仁, 孙宝民. 钩藤碱提取工艺研究[J]. 吉林林学院学报, 1998, 14(2): 1090.

[7] 杜 旭. 钩藤的研究(3): 钩藤的降压活性成分及提取过程中含量的变化[J]. 国外医学中医中药分册, 2000, 26(6): 370.

[8] 黄卓谦, 刘建利, 王玉英, 等. 钩藤煎煮过程中化学成分变化的研究[J]. 西北大学学报, 2008, 38(10): 787.

2010-11-20

[修回日期] 2011-06-28

Studiesonthermalstabilityoftotalalkaloidsinrhynchophylline

LIU Wei1, YANG Xue-ping1, WANG Zhong-shi1，2，WANG Meng1, ZHANG Qiang1, HAO Li-yong2

(1. No.88 Hospital of PLA, Taian 271000，China; 2. Taishan Medical College, Taian 271000，China)

ObjectiveTo investigate the effect of heating on total alkaloids inrhynchphylla.MethodsHPLC was employed to determine rhynchophylline and isorhynchophylline in total alkaloids among various conditions.ResultsComparing with rhynchophylline, isorhynchophylline was unstable to heating. Heated in 60 ℃ and 90 ℃ for 2 hours, isorhynchophylline content decreased more than 38% and 50%, respectively. But rhynchophylline solution was stable in 60 ℃ for 2 hours and 4 ℃ for 6 days. In addition, rhynchophylline and isorhynchophylline were more stable in salt formation.ConclusionIsorhynchophylline was unstable to heating, which was the reason forrhynchophyllato given later.in decoct herbal medicine.

rhynchophylline；isorhynchophylline；rhynchphylla total alkaloids

山东省科技发展计划项目(2008GG2NS02006).

刘 卫(1967-)，男，主任药师.Tel: (0538)8839329, E-mail:liutrunk@hotmail.com.

R931.6

A

1006-0111(2011)06-0442-03

1)P<0.05，与常温比较