基于网络药理学的羌活-益智仁药对联合糖皮质激素治疗肾病综合征机制研究

顾浩 ，王娟，韩森，李立，赵宁，傅强，崔赵丽，丁治国，王光磊，姜淼

1.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700；2.潍坊市中医院，山东 潍坊 262699；3.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；4.北京中医药大学东直门医院东区，北京 101100

肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）以肾小球滤过膜损伤导致的大量蛋白尿（尿蛋白＞3.5 g/d）、低蛋白血症（血浆白蛋白＜30 g/L）、高脂血症及水肿等为主要症状。现代医学治疗NS 多以糖皮质激素为首选药物，但长期使用会引发真菌感染、器官衰竭等多种不良反应，尤其是幼儿常产生激素依赖性，影响患儿生长发育。

国医大师吕仁和教授治疗NS 特别是小儿NS 收效颇佳。在控制NS 急性发作期临床症状、降低尿蛋白、疾病稳定期激素减量，以及降低激素不良反应方面均有独特疗效与体会。吕老治疗小儿NS 常用羌活与益智仁配伍作为君药，随证组方[1]。吕老认为，羌活具有促进肾上腺皮质生理功能改善的作用，对于控制NS 病情大有裨益，特别是在病情稳定后，应用羌活（10～20 g/剂）有利于顺利减少激素用量；益智仁为温补脾肾药，有温脾止泻摄涎、暖肾缩尿固精之效，能够降低糖皮质激素所致不良反应，促进患儿智力发育，保护肾功能，在成人NS 治疗中亦可应用。二药联用，温脾益肾、除湿解表，可加强糖皮质激素治疗作用并降低其不良反应，随证结合扶阳、清里、润肺、温中等法，临床疗效甚佳。

为深入探讨羌活-益智仁药对治疗NS 的作用机制，本研究应用网络药理学方法，对二药的活性成分、治疗靶点和作用通路进行分析，构建羌活-益智仁药理网络及NS 疾病网络，并将二药治疗NS 作用通路与糖皮质激素作用于NS 相关通路网络进行比对分析，探讨其作为糖皮质激素补充疗法的药理作用，以期为该药对的进一步应用开发和临床中西医结合用药提供依据。

1 资料与方法

1.1 羌活-益智仁药对活性成分收集

在TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和TCMID（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）数据库输入关键词“羌活”和“益智仁”，得到药物成分信息，筛选口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18 的化学成分作为羌活-益智仁药对活性成分。

1.2 羌活-益智仁药对和糖皮质激素靶点筛选

将筛选出的羌活-益智仁药对活性成分输入TCMSP 和Stitch 数据库（http://stitch.embl.de/），得到药物活性成分作用靶点，筛选去除重复靶点后，逐一录入Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/），检索人类的靶点蛋白名称（official symbol）和Uniprot ID编号。

利用 GeneCards（http://www.genecards.org/）、NCBI-gene （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene ）、OMIM（http://www.omim.org/）数据库，输入关键词“Glucocorticoid”，检索得到糖皮质激素治疗靶点。

1.3 肾病综合征相关靶点检索

利用GeneCards、NCBI-gene、OMIM、Malacard（https://www.malacards.org/）数据库，输入关键词“nephroticsyndrome”，检索得到NS 相关靶点。

1.4 肾病综合征靶点网络构建

利用String 数据库（https://string-db.org/），输入NS靶点，选取combined_score≥0.95的高可信度关系作为疾病网络的边，构建NS疾病网络，并通过Cytoscape3.7.2软件（https://cytoscape.org/）进行展示和分析。

1.5 肾病综合征靶点网络模块分析

利用Cytoscape3.7.2 软件中的MCODE Cluster 算法[2]，按默认参数（NodeScoreCutoff：0.2；Haircut：true；Fluff：false；K-Core：2；Max.Depth fromSeed：100）对NS靶点网络进行模块划分，将复杂网络分解为多个亚网络，进而分析核心靶点组合模块。

1.6 KEGG 通路富集分析

利用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对羌活-益智仁靶点、糖皮质激素靶点及NS靶点进行KEGG通路富集分析。利用TBtools软件（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）对三者在靶点和通路层面的异同进行比较。

2 结果

2.1 药物活性成分

通过TCMSP 和TCMID 数据库检索并筛选OB≥30%、DL≥0.18 的羌活-益智仁药对活性成分共18 种，其中羌活15种、益智仁4种，谷甾醇（sitosterol）为两药共有成分，见表1。

2.2 药物和疾病靶点

通过数据库检索并整理，得到羌活活性成分作用靶点83个，益智仁活性成分作用靶点51个，糖皮质激素治疗靶点2695个，NS 相关靶点1229个。羌活-益智仁药对与糖皮质激素的共同靶点有68个，其中26个与NS相关。

2.3 疾病靶点网络

通过String 数据库构建NS疾病靶点网络，网络中共有320个节点、1018条边，见图1。该网络直径为9，网络最短路径占网络所有路径的65%，节点平均邻居数为6.37，特征路径长度为3.647，网络中心性为0.16，网络聚集系数为0.414，表明该网络具有小世界特性。节点度（degree）表示与网络中某一节点关联的其他节点的数量。该网络的度分布符合幂次分布特征，回归系数为0.835。排名前15位的NS疾病靶点见图2。

图1 NS疾病靶点网络

图2 NS疾病靶点网络核心靶点（前15位）

2.4 疾病靶点网络模块分析

利用MCODE 网络模块划分方法，对NS疾病靶点网络降维分解，得到20个核心模块，见图3。6个模块未发现药物作用靶点。有药物干预靶点的模块14个，其中糖皮质激素特有的作用模块11个，糖皮质激素和羌活-益智仁药对共同作用靶点的模块3个，见表2。6个羌活-益智仁药对的靶点分别为RELA、TNF、CASP8、IL10、CXCL8和APOE。

图3 NS疾病靶点网络模块划分结果

2.5 羌活-益智仁药对作用通路分析

KEGG富集得到羌活相关通路65条，益智仁相关通路26条，NS相关通路106条（P＜0.05）。羌活-益智仁药对与NS直接相关通路33条，其中6条为羌活与益智仁的共同通路，见图4。

2.6 羌活-益智仁药对与糖皮质激素联用通路分析

KEGG 富集得到羌活-益智仁药对通路69条，糖皮质激素通路166条（P＜0.05）。羌活-益智仁药对与糖皮质激素治疗NS 作用通路网络见图5。其中与NS相关通路33条。羌活-益智仁药对独有作用通路7条，分别为逆行内源性大麻素信号、ABC运输车、脂肪的消化吸收、尼古丁成瘾、阿尔茨海默病、GABA 能突触、精氨酸和脯氨酸代谢通路，与NS不直接相关。

表2 NS疾病靶点网络模块涉及羌活-益智仁药对和糖皮质激素靶点

图4 羌活-益智仁药对作用于NS相关通路分析

图5 羌活-益智仁药对与糖皮质激素治疗NS 作用通路网络

3 讨论

NS 属中医学“水肿”范畴，小儿NS 多属本虚标实之证，本虚即肺、脾、肾三脏正气亏损，以肾虚为主，临床采用滋阴、补肾、利水治法[3]。羌活通经活络、行气活血止痛，配伍益智仁补肾健脾，通中有补，符合NS 本虚标实病机，祛邪扶正兼顾。吕老常以羌活-益智仁药对作为复方君药，联合糖皮质激素控制NS病情发展，疗效显著且不良反应少，尤其用于病情反复、激素减量过程中复发、激素疗效不佳的患儿每获良效。吕老认为，顺应人体自然规律，糖皮质激素应于每日8 点前肾上腺激素分泌水平最高时服用，激素冲击治疗效果稳定后逐渐改为隔日服用。羌活可健脾补肾，消除尿蛋白，激活肾上腺皮质功能，从而对明显的库兴氏综合征有积极效果。配伍补肾健脾的益智仁，可辅助糖皮质激素的治疗作用并降低其不良反应。

本研究显示，糖皮质激素与羌活-益智仁药对共同通路共62 条，其中作用于NS 的通路33 条，PI3K-Akt、弓形虫病、乙肝、利什曼病、美国锥虫病、结核、NF-κB、小细胞肺癌、TNF 和甲状腺激素等通路在疾病治疗过程中起主要作用。研究表明，REAL、TNF-α、CASP8、IL10、CXCL8 和APOE 等基因与小儿NS 的发病与复发[4-5]、足细胞损伤[6]、尿蛋白产生[7]、降低细胞凋亡[8]、炎症反应[9]、调节脂代谢[10]等有关，这些因素与NS 的发生发展密切相关。PI3K-Akt、HIF-1、雌激素、小细胞肺癌等相关通路被证实可以通过延缓肾脏纤维化[11-12]、促进肾小球足细胞增殖[13-14]、缓解小细胞肺癌的C-Mip 过表达等途径改善肾脏功能[15]。而且，抑制NF-κB/TNF-α 信号通路的表达[16]、调整甲状腺激素水平[17]、改善阿米巴原虫感染通路[18]、改善胰岛素抵抗水平[19]均可改善慢性肾功能衰竭微炎症状态，减轻肾间质纤维化，从而起到减轻肾损伤的作用。因此，羌活-益智仁药对通过作用于相关靶点并调节相关通路，可以增强糖皮质激素的治疗作用，与吕仁和教授临床经验相符。

糖皮质激素抵抗不仅会降低外源性糖皮质激素对疾病的治疗效果，而且可使内源性糖皮质激素无法发挥其应有效用，从而对机体造成严重损害，羌活-益智仁能通过多靶点、多途径调节NF-κB 信号通路，与西药联用可能减少糖皮质激素抵抗作用[20]。此外，糖皮质激素可诱导脂质成分进入股骨头并沉积在脂肪细胞和骨细胞中，导致股骨头坏死，羌活-益智仁能够调节脂肪的消化吸收通路，有助于防止脂质成分沉积[21]。肝细胞色素P450-3A 酶可减少股骨头坏死面积[22]，羌活-益智仁可直接作用于细胞色素P450通路，对降低糖皮质激素诱导的股骨头坏死有重要意义。

通过NS 疾病网络模块化分析，发现羌活-益智仁作用于3 个重要的NS 疾病模块，糖皮质激素覆盖了14 个模块，两者联用，涉及疾病模块总数的70%。模块1 中，仅有1 个靶点SERPINF2 无药物作用。该靶点主要与肝脏纤维化有关，能治疗α-2-antiplasmin缺乏症[23]，推测可作为NS 药物潜在靶点。模块4 中，仅1 个靶点HRAS 没有药物作用。HRAS 基因突变与Ras/MAPK 信号通路有关[24]，而Ras/MAPK 通路与NS 治疗密切相关[25-26]，提示HRAS 可能是NS 疾病治疗靶点，尚需进一步研究和论证。通过核心靶点模块研究，可为潜在疾病靶点发现和药物组合设计提供一定依据和思路。

本研究利用网络药理学对羌活-益智仁药对联合糖皮质激素治疗NS 的增效减毒机制进行了解析，研究结果尚需设计严谨的试验加以验证。在不断积累基础研究数据的同时，结合名老中医的宝贵经验，可为临床新药研发提供方向和依据。