Cx26在D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤中的表达

王 斌，赖硕林，宋豫皎，何欣然，王烨婷，赵钐妤

（1.大理大学第一附属医院，云南大理 671000；2.大理大学临床医学院，云南大理 671000；3.大理大学基础医学院，云南大理 671000）

缝隙连接（gap junction，GJ）也叫间隙连接或通讯连接，是细胞间直接通讯的方式之一。GJ是一种特殊的膜结构，由相邻两个细胞间的连接通道排列而成，其基本单位是连接子，每个连接子由6个缝隙连接蛋白（connexin，Cx）环绕排列成中空的半通道而成，即跨膜蛋白通道〔1〕。GJ 有细胞连接的机械作用，亦能促进邻近细胞间电信号及化学信号的传递，对细胞的新陈代谢、增殖分化、机体内外环境的稳定等生理过程起着重要的调控作用〔2〕。GJ 细胞间信号交流对于肝脏的生物学性能具有重要作用，可参与血浆蛋白的合成等〔3〕。目前所发现的Cx 有20 多种，根据分子量的大小对其命名。在肝脏中主要表达有Cx26、Cx32、Cx37、Cx40、Cx43〔4-5〕，有研究表明，在急性肝损伤中，连接蛋白有不同的表达及变化格局〔6〕，而研究主要集中于脂多糖、四氯化碳等诱导的急性肝损伤中Cx26、Cx32 及Cx43 的表达。D-半乳糖胺亦可引起急性肝损伤，但机理与其他因素不同，D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤，并不直接损伤肝细胞，但可干扰肝细胞磷酸尿嘧啶核苷。D-半乳糖胺进入体内后与磷酸尿苷结合，形成磷酸尿苷-半乳糖胺复合物，致磷酸尿苷耗竭，使依赖其生物合成的核酸、糖蛋白、脂糖等的合成受到抑制，限制细胞器及酶的生成和补充，细胞器、生物膜受损、钙离子内流，从而造成肝细胞损伤〔7〕。在D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤中，Cx26 的表达如何，尚未见报道。因此，本研究建立D-半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤模型，观察其肝功能情况、肝组织病理改变、Cx26 的蛋白及mRNA 表达情况，旨在阐明Cx26在D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤中的作用。联苯双酯是治疗病毒性肝炎和药物性肝损伤的常用药物，本研究采用联苯双酯作为阳性对照药，以期阐明其治疗肝损伤的机制与Cx26的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性SD 大鼠15 只，体质量150～180 g，由昆明艾尼莫实验动物养殖中心提供，合格证号：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 主要药物、试剂及仪器D-半乳糖胺盐酸盐（MACKLIN 公司，批号：D810561）；联苯双酯（MACKLIN公司，批号：D843898）；Cx26（Bioss公司，批号：bs-1715R）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，Servicebio公司，批号：GB12002）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（Servicebio 公司，批号：G2003）；动物组织总RNA 提取试剂盒（离心柱型）（天根生化科技（北京）有限公司，批号：DP431）；FastKing cDNA 第一链合成试剂盒（去基因组）（天根生化科技（北京）有限公司，批号：KR116）；SuperReal 荧光定量预混试剂（增强版）（SYBR Green）（天根生化科技（北京）有限公司，批号：FP205）；β-actin 内参基因（生工生物工程（上海）股份有限公司，货号：B661202）。DT5-3型低速台式自动平衡离心机（北京时代北利离心机有限公司）；生化分析仪（型号：7180，日立公司）；Real-Time PCR 仪（Applied Biosystems 公司）；显微镜（型号：E100，NiKon公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型建立 将15 只大鼠随机分为3 组，其中正常对照组（Con 组）、D-半乳糖胺组（D 组）、D-半乳糖胺-联苯双酯组（D-联组）各5 只。 所有动物按照实验室大鼠饲养标准进行饲养，室温保持在（25±1）℃。饲养2 d适应环境后，给药。Con组：腹腔注射0.5 mL 无菌0.9%氯化钠溶液；D 组：用0.9%氯化钠溶液将D-半乳糖胺盐酸盐配成10%溶液，再用1 mol∕L NaOH溶液调节pH至7.0，按400 mg∕kg 体质量一次性给予腹腔注射〔7〕；D-联组：在注射D-半乳糖胺前1 h 腹腔注射联苯双酯20 mg∕kg〔7〕。给药24 h后麻醉老鼠，取其静脉血，处死老鼠，取其肝脏。

1.3.2 标本处理方式 取出肝脏组织后迅速称重，并计算肝体比指数（肝体比指数=肝湿重∕体质量×100%）。选取2块肝组织，其一放于4%多聚甲醛中固定48 h，用于石蜡切片，苏木精-伊红（Hematoxylineosin，HE）染色；其二放于样本保护液中，便于提取RNA 或蛋白，用于实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time qPCR）实验或蛋白质印迹法（Western Blot，WB）。

1.3.3 血清指标检测 每只大鼠取血后，3 000 r∕min离心5 min，取上清液，采用速率法测定血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的含量。

1.3.4 病理改变观察 肝脏组织进行固定、脱水、透明、浸蜡与包埋、切片、脱蜡、染色、封固等处理后，在显微镜下观察肝脏病变情况。

1.3.5 WB 检测Cx26 蛋白的含量 肝脏组织加入裂解液研磨提取总蛋白，加入蛋白缓冲液沸水煮15 min 进行蛋白变性，蛋白进行SDS-PAGE 电泳、转膜、免疫反应（一抗1：500，5%脱脂奶粉；二抗1：3 000），化学发光。采用Alpha 软件处理系统分析目标条带的光密度值（Cx26含量=Cx26条带灰度值∕GAPDH内参条带灰度值）。

1.3.6 Real-time qPCR 法 检 测Cx26 的mRNA 含 量各组组织按动物组织总RNA 提取试剂盒操作步骤进行RNA 的提取，测浓度，按FastKing cDNA 第一链合成试剂盒将RNA 逆转为cDNA，严格按照SuperReal 荧光定量预混试剂进行RT-PCR 检测。其中引物由生工生物合成，Cx26基因序列在NCBI上查找（正向引物：CTACACCACCAGCATCTTCTTCCG，反向引物：CCAGGCGTTACACTTCACCAGAC）。以β-actin 为内参基因。采用2-△△Ct法对目的基因进行定量分析。

1.4 数据处理所有数据经SPSS 17.0 软件进行处理，数据以（xˉ±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝体比指数与D组相比，D-联组肝体比指数稍增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。其余差异无统计学意义。见表1。

表1 大鼠肝体比指数（xˉ± s，n=5）

2.2 大鼠血清中AST、ALT 含量与Con 组相比，D组及D-联组血清中AST、ALT 含量均明显增高（P＜0.05）；AST∕ALT值均明显降低（P＜0.05）。而D组与D-联组差异无统计学意义。见表2。

表2 大鼠血清中AST、ALT含量测定结果（xˉ± s，n=5）

2.3 各组间病理改变情况Con 组肝小叶结构正常，肝细胞正常；D 组可见肝小叶结构破坏，明显的肝细胞坏死及炎症细胞浸润，肝血窦变窄；D-联组情况同D组相似，但炎症细胞浸润更为明显。见图1。

2.4 Cx26 蛋白含量与Con 组（0.405 8 ± 0.162 5）相比，D 组（0.635 4±0.114 9）Cx26 蛋白含量明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；D-联组（0.473 1±0.219 7）稍有增加，差异无统计学意义。与D 组相比，D-联组Cx26 含量下降，但差异无统计学意义。见图2。

图2 Cx26蛋白的表达

2.5 Cx26 的mRNA 含量 与Con 组相比，D 组及D-联组中Cx26 的mRNA 含量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与D 组相比，D-联组Cx26 的mRNA含量降低，但差异无统计学意义。见表3。

表3 Cx26的mRNA含量（xˉ± s，n=5）

3 讨论

肝脏是体内重要的脏器，也是各种疾病常侵袭的器官，代谢、中毒、微生物、循环障碍及肿瘤等均可造成肝脏的损伤。本研究结果表明，在D-半乳糖胺引起的肝损伤中，血清中AST、ALT 显著升高，提示模型复制成功。ALT 分布于细胞浆，对肝脏疾病最为敏感；AST分布于肝细胞浆和线粒体中，本实验结果显示AST∕ALT 值比Con 组降低，提示由D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤，损伤了肝细胞的细胞膜，但是对细胞器的损伤可能还不严重。

GJ 通道允许电、化学信号及代谢产物通过，GJ信号交流受细胞因子、生长因子、一氧化氮等的调控，使其对于细胞损伤比较敏感〔6〕。肝脏中主要表达5 种连接蛋白，其中肝细胞主要表达Cx26、Cx32，非实质肝细胞主要表达Cx37、Cx40 和Cx43〔4-5〕。研究表明，Cx26、Cx32 及Cx43 与药物、脂多糖及缺血再灌注损伤相关的肝急性损伤及炎症密切相关〔6〕。以往对Cx 在急性肝损伤中的研究主要集中于脂多糖、四氯化碳，对乙酰氨基酚等造成的急性肝损伤则主要针对Cx32 和Cx43〔6〕，对Cx26 的研究较少。在体外培养的肝细胞中，抑制Cx26 和Cx32 可减少由对乙酰氨基酚引起的细胞死亡〔9〕；封闭Cx26 和Cx43，阻碍Cx43的过表达可能是减少急性毒性引起的肝损伤的潜在治疗靶点〔6〕。脂多糖引起的SD 大鼠肝损伤中，Cx26 和Cx32 减少，Cx43 增加，这跟炎症反应密切相关〔10-11〕。有研究〔12〕认为，这些Cxs 在基因水平上表达的下调是通过转录后机制形成的。本研究结果表明，D-半乳糖胺可引起SD 大鼠肝细胞坏死及炎症细胞浸润，Cx26 的蛋白含量明显增加，而mRNA 含量却明显降低。Cx26 蛋白表达增加可能跟炎症反应相关，或许是适应D-半乳糖胺的刺激，为致细胞损伤的因子进行细胞间的交流提供方便。由此可推测，抑制Cx26 的表达，也许是治疗由于D-半乳糖胺引起的急性肝损伤的潜在靶点。Cx26 的蛋白及mRNA 含量不一致，可能是mRNA 半衰期短或者是存在转录后调控的问题，有待进一步研究。

本研究中采用联苯双酯作为阳性对照药，结果显示联用联苯双酯组大鼠血清AST 及ALT 并未降低，肝细胞坏死依然明显，这可能源于给药时间短及次数少。但联苯双酯在一定程度上逆转了Cx26的表达，可推测联苯双酯治疗肝损伤的机制可能跟细胞间直接的信号交流有关。

通过对Cx26 在D-半乳糖胺引起的大鼠急性肝损伤中的表达进行研究，发现其表达升高，提示若抑制Cx26 的表达，或许可减少与D-半乳糖胺致病机理类似的药物性损伤的细胞间的信号交流，为新药研究提供一定的实验支持，为药物治疗机制的阐明提供一定的佐证。Cx26 受何调控，为何其在基因、蛋白水平表达不一致等问题，有待进一步研究。