双液相萃取棉仁粉工艺中甲醇相棉子糖s的精制

顾 恒 朱庆莉 云 志 兰宏兵

(金陵科技学院1，南京 211169)(南京工业大学2，南京 211816)(郑州轻工业大学3，郑州 450001)

棉子糖(Raffinose)是由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成的一种三糖，也被称为蜜三糖、蜜里三糖。它是一种植物体内普通存在的功能性低聚糖，具有很好的双歧杆菌增殖作用和良好的整肠功效[1]，还能促进人体对钙的吸收，阻止癌细胞生长，延长器官等的保存时间，故广泛地应用于食品、医疗、化妆品等行业[2-4]。

棉花是我国主要的经济作物之一，棉籽是棉花主要副产品，因此从棉籽中提取棉子糖，不仅获得高价值产品，还提高资源的综合利用率[5]。近几十年来，众多科研者围绕如何从棉籽中提取棉子糖开展许多工作，如采用酶解提取结合离子交换树脂法[6]，光波提取、陶瓷膜过滤，结合离子吸附法[7]提纯棉子糖。崔胜成等[8]采用乙醇提取棉子糖，浓缩提取液，淡盐水洗涤，结晶过滤得到棉子糖。赵永强等[9]公开一种经乙醇浸泡，过滤，加入晶种，再加入3～5倍乙醇，羟基型阴离子除杂，醋酸乙醇洗脱，浓缩等步骤从棉籽粕中获得高纯度棉子糖的方法。曹通等[10]公开一种以脱脂棉粕为原料，通过低浓度弱碱性有机溶剂萃取棉酚，从脱酚液中提取棉子糖，但未公开具体的提取过程与产率。

本课题组采用甲醇和石油醚按一定比例(3∶1)混合组成的双液相溶剂(TPS)浸取处理棉仁粉[11-13]。通过该操作过程，棉仁粉中棉籽油、甾醇、维生素E等脂溶性物质进入到上层石油醚相；而棉子糖、棉酚、色素等则进入下层甲醇相。该过程通过一步萃取，实现了不同极性物质的分离。同时两相溶剂相互洗脱，使得各自萃取得到的物质相对较纯，提高萃取效率。经分离得到的下层溶液甲醇相中富含棉子糖，但同时也含有棉酚、色素、蛋白质等多种物质，这些杂质严重影响棉子糖的色泽及纯度，因此欲得到高纯度的棉子糖，还需要进一步精制[14]。课题组虽采取了一系列提高棉子糖纯度的措施[15，16]，但未能兼顾纯度与产率，也缺乏整体连贯性，未见从原料(双液相溶剂萃取棉仁粉工艺中甲醇相)直接到达产品(高纯度棉子糖)的整体操作路线。

本实验以双液相溶液萃取棉仁粉中的甲醇相为原料，依次通过脱色、脱蛋白及重结晶操作，拟获得高纯度、高产率的棉子糖产品，欲拓展双液相溶剂(TPS)处理棉籽的工艺路线，进一步提升这一工艺的实用价值。

1 材料与方法

1.1 主要原料与试剂

棉仁粉，江苏连云港棉籽，经电动粉碎后去棉粕得棉仁粉；甲醇相溶液，自制[7]，双液相溶剂萃取棉仁粉后，固液分离，溶液静置分层，分离后下层溶液即为甲醇相；硅藻土、粉末活性炭、棉子糖标品；无水乙醇、丙酮、乙醇、三氯乙酸均为分析纯。

1.2 仪器

Agilent 1100 型高效液相色谱，外压式中空纤维超滤器(表1)，RE-5299旋转蒸发器。

表1 膜组件技术指标及规格

1.3 预处理

甲醇相中含有棉酚和棉子糖。棉酚不溶于水，在低浓度的甲醇溶液中也几乎不溶，而棉子糖在水中溶解度大，因此利用棉酚与棉子糖在低浓度甲醇溶液中溶解度不同将棉酚除去。具体操作步骤为：向甲醇相中加入甲醇相体积30%的蒸馏水，再减压蒸馏蒸出甲醇，大部分的棉酚在水相中析出，抽滤去除后，收集得到含糖水相，其组成成分见表2。

表2 含糖水相主要成分

1.4 棉子糖纯化工艺

1.4.1 硅藻土与活性炭混合物处理棉子糖粗品

将含糖水相溶解于无水乙醇中，含糖水相与无水乙醇体积比1∶10，充分振荡混合液使其均匀。将溶液置于离心管中，在5 000 r/min的转速下离心15 min。将上层清液去除，下层移至烧杯中，放入真空干燥箱中干燥除去溶剂。取干燥后的2 g粗品溶解于25 mL的蒸馏水中，加入硅藻土与活性炭的混合物(混合物中两者的比例为1∶1)，超声波辅助机械搅拌15 min，真空抽滤，并用100 mL的蒸馏水分次洗涤，收集合并滤液，50 ℃真空干燥。

1.4.2 棉子糖溶液超滤除蛋白质

脱色处理后的棉子糖粗品中仍含有水溶性蛋白质等杂质。为了避免蛋白溶液的起泡影响后续的浓缩过程及得到高纯度产品。实验采用膜超滤分离技术处理棉子糖粗品中蛋白。超滤实验装置见图1所示。

取10 g棉子糖粗品配制成1.5 L棉子糖溶液，将其放入料液贮槽1，启动料液泵2，由阀门3和6控制超滤膜内料液流量，压力表4和5显示膜的进口压力和出口压力。料液由泵入超滤系统后，采用全循环模式，即渗透液循环回至原料液贮槽，透过液收集于渗透压储存槽。

注：1 料液贮槽；2 料液泵；3 进口调节阀；4 进口压力表；5 出口压力表；6 出口调节阀；7 浓缩液；8 原料液；9 渗透液；10 渗透液贮槽；11 控温水浴。图1 超滤实验装置图

式(1)计算超滤压力，式(2)计算超滤膜通量，膜通量通常用单位时间内通过单位膜面积的透过液的体积来表示[17]。质量分数30%的三氯乙酸(TCA)溶液用于检测超滤透过液是否含有蛋白物质[18]。

(1)

式中：P为膜操作压力/MPa；Pin为超滤膜进口处的压力/MPa；Pout为超滤膜出口处的压力/MPa。

(2)

式中：J为超滤通量/L·m-2·h-1；V为取样体积/L；t为取样时间/h；A为膜面积/m2。

1.4.3 棉子糖的重结晶

经脱色、超滤处理后的棉子糖溶液真空干燥，所得棉子糖样品仍还有杂质，需进一步精制。具体步骤如下：取一定量棉子糖粗品，在超声加热下，溶解于重结晶溶剂(丙酮-乙醇-水，体积比2∶1∶0.5)中，直至粗品溶解。趁热过滤，滤液室温下超声辅助冷却结晶。滤液再置冰箱中冷冻结晶，一段时间后，振荡抽滤得到晶体，晶体分别经石油醚、乙醇洗涤两次。晶体真空干燥，称重，计算其收率及纯度。

1.5 分析方法

1.5.1 色值分析

色值表示糖品颜色深浅的数值，是评价糖品质量的重要指标。实验用国际糖分析统一方法委员会(ICUMSA)规定的糖色值分析方法进行测定[19]。

(3)

式中：IU560为560 nm处国际糖溶液色值；A560为560 nm处测得的样液吸光度；

b为比色皿厚度，1 cm；c为样液干物质质量浓度/mg/mL。

1.5.2 棉子糖的检测，及脱色率及收率计算

采用高效液相色谱法(HPLC)检测棉子糖的含量，具体检测方法参照文献[14]。

围绕“实践”概念所产生的争论如此之多，并不是中国独有的现象。再回到布尔迪厄所在的法国，对他的批评同样猛烈而旷日持久。

(4)

(5)

式中：V1、V2分别为脱色前后溶液的体积/mL；C1、C2分别为脱色前后溶液中棉子糖的质量浓度/mg/mL。

(6)

2 结果与讨论

2.1 硅藻土与活性炭混合物处理棉子糖粗品

2.1.1 脱色温度的确定

温度升高有利于降低溶液黏度，增强分子的扩散运动。图2a映了随着温度的升高，脱色效果几乎呈线性提高，但与此同时棉子糖收率逐渐降低，当温度高于50 ℃后，可能发现一些副反应，收率急剧下降。因此选择50 ℃作为适宜的脱色温度。

2.1.2 脱色时间的确定

混合物与棉子糖溶液有一定的接触时间是提高脱色率的必要条件。从图2b可以看出，随着脱色时间的延长，脱色率不断提高，当脱色时间延长至2.5 h后，脱色率没有明显增加趋势；但随着时间的延长，收率不断下降，而且下降的速率越来越明显，因此从经济，脱色率及收率等方面考虑，确定脱色时间为2 h。

2.1.3 硅藻土与活性炭混合物用量的确定

硅藻土和活性炭作为脱色剂最佳的脱色条件：混合物用量为3%，在50 ℃下脱色2 h。在此条件下，棉子糖的收率为85.6%，脱色率为89.1%。

2.2 棉子糖溶液超滤脱蛋白

2.2.1 超滤时间对膜通量的影响

取棉子糖溶液，测定pH为6，总蛋白质浓度为3.2%，在40 ℃下进行实验，膜通量随时间的变化如图3所示。随着超滤时间的延长，膜通量逐渐减小。开始膜通量下降得较快，而后其下降速率随时间延长而变得缓慢，超滤进行至20～30 min后，膜通量趋于稳定。

2.2.2 操作压力对膜通量的影响

压差是超滤过程的推动力，分别取蒸馏水和脱色后的棉子糖溶液，在40 ℃下稳定运行20 min后，调节进出口阀，在不同操作压力下的测定膜通量。从图3可看出，膜通量随压力升高而增大，而后逐渐趋于稳定，0.016 MPa后膜通量几乎不再增大。这可能是因为随着压差的增大，大分子物质会不断被溶剂带至膜表面积累，形成由膜表面到主体溶液之间的浓度差，形成浓差极化现象。随着浓差极化程度的加剧，膜表面的溶质质量分数急剧增加。当膜表面的质量分数达到饱和时，就在膜面形成凝胶层，产生了凝胶层阻力，此时膜通量的变化不再依赖于压力。因此本实验选择操作压力0.016 MPa。

图2 各因素对棉子糖脱色率与收率的影响

图3 各因素对膜通量的影响

2.2.3 料液温度对膜通量的影响

取蒸馏水和脱色处理后的棉子糖溶液，在膜允许的温度范围内(5～45 ℃)调节料液的温度，在操作压力0.016 MPa的条件下运行20 min，测定其膜通量。由图3可知，在超滤过程允许的工作温度下，随着料液温度的升高，膜通量相应增加，温度和膜通量速度变化基本呈线性关系。这是由于温度升高，加快膜中聚合物链节的微观布朗运动，使单位时间单位体积形成小孔的可能性增加，从而使透过速度增大，其次分子热运动速度加快，各种分子向膜表面及其由膜表面向溶液主体扩散速度加快，即增大了传质系数，从而提高了膜通量。而且糖溶液随温度升高黏度下降，溶剂更容易透过膜；蛋白质溶解度随糖溶液温度升高而增加，可降低膜表面对蛋白质的吸附。为了提高效率，应选择较高的物料温度，但操作温度的选择还受到膜材料耐热性和物料热敏性的限制，为了延长膜的使用寿命，本实验选择操作温度为40 ℃。

2.2.4 pH对膜通量的影响

从图3可以看出，当料液温度(40 ℃)、操作压力(0.016 MPa)均保持不变时，溶液的pH值对膜通量有较明显的影响，与文献[20]报道相似。在碱性条件下，膜通量较大，随着溶液pH值减小膜通量逐渐减小，在pH值为5左右时，膜通量达到最低值，pH值再减小时膜通量又趋于增大。这种现象产生的原因可能是糖溶液中所含蛋白质中的氨基酸同时具有氨基和羧基，可解离为负电荷和正电荷基团，是一种两性化合物，当pH为某一特殊值时所带净电荷为零，即蛋白质的等电点。蛋白质在等电点处其溶解度最小。由图3可以看出，棉子糖溶液中蛋白质等电点在pH值为5左右，此时蛋白质最易析出和聚集在膜的表面，形成最紧密吸附层，对流体的阻力最大，因而膜通量最低。当溶液pH值偏离等电点时，溶液中蛋白将带有电荷，溶质分子间的静电排斥力变大，溶液黏度变小，膜通量增大。因此膜超滤应该在偏离等电点时进行，可将糖溶液pH调到8进行实验。

在温度40 ℃，压力0.016 MPa，糖溶液pH=8下进行20 min膜超滤实验。收集渗透液，用质量分数30%的三氯乙酸进行检测，超滤后溶液中未检测出蛋白质。

2.3 棉子糖的重结晶

2.3.1 重结晶料液比的确定

由图4可知，在棉子糖粗品质量一定的情况下，棉子糖的收率与纯度是相互制约的关系。在料液比较小时，析出的晶体中含有大量的棉子糖及杂质，产品的收率大，但纯度较低；随着液固比增加，溶解于溶剂中的棉子糖与杂质的质量上升，使得晶体中棉子糖的含量相对增加，因此产品的纯度较高，但其收率小。综上所述，兼顾产品的收率与纯度，选择较为合适的料液比1∶14。

图4 重结晶因素对棉子糖收率和纯度的影响(a)料液比(b)结晶时间

2.3.2 重结晶时间的确定

由图4可以看出，随着重结晶时间的延长，晶体的质量呈先增加后平稳的趋势。当时间延长至24 h后，晶体的析出量已无明显增加，同时太长的结晶时间会引起晶体结块的现象。因此，从经济及晶体晶型的角度考虑，确定结晶时间为24 h。

由超声辅助双液相溶剂萃取后所得的棉子糖溶液经硅藻土与活性炭混合物脱色、再经超滤脱蛋白、溶剂重结晶后，最终得到纯度为94.5%，回收率为63.1%的棉子糖(以原料甲醇相为基点计算)。

3 结论

以双液相溶剂(甲醇和石油醚)萃取棉籽工艺中甲醇相为原料，在预处理的基础上，采用3%硅藻土与活性炭(混合物与糖溶液质量之比)在50℃下脱色2 h，棉子糖的收率为85.6%，脱色率为89.1%；在温度40 ℃，压力0.016 MPa，糖溶液pH=8下超滤膜脱蛋白20 min，可将棉子糖提取液中大分子蛋白有效地除去；在糖溶液与重结晶溶剂(丙酮-乙醇-水，体积比2∶1∶0.5)料液比为1∶14的条件下，重结晶棉子糖粗品24 h，最终得到的棉子糖产品纯度为94.5%，回收率为63.1%。

该工艺与传统的棉子糖提取工艺相比，有一些明显优点：避免了高温处理棉籽，保护了生物质的活性；前期萃取过程减少萃取步骤，提高萃取效率，节约能源；此工艺首次较系统、完整地研究了从原料(甲醇相)到产品(棉子糖)的提纯过程；该工艺兼顾棉子糖的回收率与纯度，且简单易行。