鞣花酸磷脂复合物制备及其对植物油抗氧化作用

蒋新龙 吴小刚 郭叶莹 陈品品 叶小霞 蒋益花

(浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015)

鞣花酸是广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的天然多酚类物质，是一种多酚二内酯，是没食子酸的二聚衍生物，呈反式没食子酸单宁结构[1]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、皮肤增白等多种生物活性[2-4]。但由于鞣花酸分子的刚性平面结构，在水、脂质介质中均难以溶解，生物利用度低，严重制约了它的应用范围[5，6]。

为了克服鞣花酸水溶性差、药效短暂等问题，许多国内外科研工作者纷纷运用各种技术进行研究。马晶等[7]采用海藻酸钠/壳聚糖对石榴皮鞣花酸进行包裹制备成复合物微球，发现把石榴皮鞣花酸做成海藻酸钠/壳聚糖微球，可以控制所需鞣花酸的缓慢释放，能够保证微球具有更好的生物相容性；范高福等[8]采用以羟丙基-β-环糊精为包合材料，分别采用溶液研磨法、超声法、搅拌-超声法制备石榴鞣花酸-羟丙基-β-环糊精包合物，其包合物的表观溶解度提高了约10倍；山田泰司等[9]发现将含有番石榴叶提取物并且在固体成分中含有1～5%的游离鞣花酸的原料与水性介质混合，可以制备在水中的溶解性优异的鞣花酸组合物；山田泰司等[10]还发现将水溶性多酚类混合于难水溶性多酚类通过高温处理可以提高难水溶性多酚类溶于水中的溶解浓度；赵修华等[11]用反溶剂法制备了水溶性较好的鞣花酸超微粉；郑丹丹等[12]将鞣花酸溶于乳剂基质中制备成鞣花酸自微乳药物，提高了鞣花酸的溶解度和生物利用度。许多学者研究发现，多酚类化合物与磷脂之间具有特殊的亲和力，通过制备磷脂复合物，可以改善多酚类化合的脂溶性[13-17]。本团队也制备了槐花黄酮磷脂复合物，发现该复合物在水和在正辛醇中溶解性都有明显改善[18]，但鞣花酸磷脂复合物制备以提高鞣花酸的溶解度和生物活性鲜有报道。

本研究以石榴皮鞣花酸为原料采用超声-微波协同技术制备鞣花酸磷脂复合物，利用正交实验优化制备工艺条件，并初步探索该复合物的理化性质及其对植物油抗氧化作用，为开拓石榴皮鞣花酸的应用范围提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石榴皮鞣花酸(90%)、植物油为新鲜精炼核桃油和葡萄籽油、鞣花酸(476-66-4标准品，98%)、大豆卵磷脂(磷脂酸PA4-7，磷脂酰肌醇PI12-15，磷脂酰乙醇胺PE18-22，磷脂酰胆碱PC22-25)；其他试剂均为分析纯。

UV-1600型紫外可见光谱仪，UV2450紫外可见分光光度计，TENSOR27红外光谱仪，CW-2000型超声-微波协同萃取/反应仪，FW100型高速万能粉碎机。

1.2 实验方法

1.2.1 石榴皮鞣花酸的含量测定

鞣花酸含量的测定：采用紫外分光光度法测定鞣花酸得率[19]。精确称取0.01 g鞣花酸标准品，在常温搅动下滴加4 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液溶解，再用水定容至100 mL配制成100 μg/mL鞣花酸标准溶液。将鞣花酸标液稀释至一定浓度，在200～400 nm波长扫描，确定278 nm为最大吸收波长。再依据邓小莉等[18]方法制备标准曲线。得到鞣花酸质量浓度C(μg/mL)与吸光度A之间的关系式为：A=0.062 6C-0.009 6，其线性范围为0.00～10.00 μg/mL，相关系数R2=0.996 6。待测样品同法在278 nm处测定吸光值，根据回归方程计算鞣花酸含量。

1.2.2 鞣花酸磷脂复合物制备实验

以石榴皮鞣花酸和大豆卵磷脂为原料，采用超声-微波协同技术，参考制备槐花黄酮磷脂复合物方法[18]，制备鞣花酸磷脂复合物。以鞣花酸与磷脂的复合率为评价指标。

单因素实验：固定初始条件其他量不变，采用控制变量法，考察投料比(磷脂与鞣花酸的质量比)、鞣花酸质量浓度、微波功率和反应时间等因素对复合率的影响。超声条件固定(超声输出功率50 W，频率40 kHz)，分别设置鞣花酸质量浓度梯度1、3、5、7、10 mg/mL；投料比梯度1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6；微波功率梯度100、150、200、250、300 W；反应时间梯度20、25、30、35、40 min。

正交优化实验：在单因素实验的基础上，选择鞣花酸质量浓度、投料比、微波功率和反应时间4个因素为主要变量，以复合率为指标，采用 L9(43)进行正交实验。

1.2.2 鞣花酸磷脂复合物的理化性质实验

光谱分析：将一定量的磷脂、鞣花酸、鞣花酸磷脂复合物分别溶于无水乙醇溶液中，制成一定浓度的乙醇溶液，将3种溶液进行紫外全波长扫描；采用KBr压片法分别对磷脂、鞣花酸磷脂复合物在400～4 000 cm-1范围内进行红外扫描。

溶解度的测定：取20 mL溶剂(正辛醇、水)，分别加入过量的鞣花酸或鞣花酸磷脂复合物于室温下搅拌6 h，取上清液过0.45 μm滤膜，测定其上清液浓度，计算溶解度。

1.2.3 鞣花酸磷脂复合物对植物油抗氧化影响实验

1.2.3.1 鞣花酸磷脂复合物植物油样品液的制备

鞣花酸磷脂复合物油母液的制备：考虑鞣花酸磷脂复合物的脂溶性不强，根据GB 2760—2014《国家食品安全标准食品添加剂使用标准》和褚盼盼等[20]研究方法，将4%聚甘油酯加入植物油中，混合均匀，再加入0.1%的鞣花酸磷脂复合物，均质化处理10 min(1 000 r/min)，即得鞣花酸磷脂复合物油母液。

参照 GB 2760—2014中一般在植物油脂中加入天然抗氧化剂用量，本实验鞣花酸磷脂复合物浓度梯度设置为 0.01%～0.06%。按设计所需的质量分数将适量的鞣花酸磷脂复合物母液添加到植物油中，磁力搅拌至鞣花酸磷脂复合物母液与植物油充分混匀，得到系列鞣花酸磷脂复合物植物油样。

以油脂的过氧化值为衡量指标[21]，用所得到的系列鞣花酸磷脂复合物植物油样，采用GB/T5538—2005法测定过氧化值，分别测定常温下和98 ℃加热 6 h 后的POV值，根据加热后过氧化值的相对大小，确定最佳添加量。

1.2.3.2 植物油表观活化能测定

采用Schaal烘箱法[22]测定样品POV随贮藏温度、时间的变化。将最佳鞣花酸磷脂复合物添加量的植物油置于碘量瓶中密封，分别测定每隔2 d(共10 d)的置于45、55、65 ℃的电热恒温鼓风干燥箱中的样品POV0。同法空白参照。

植物油的氧化、添加促氧化剂和抗氧化剂后植物油的氧化都符合一阶动力学反应[23-25]。本研究根据一级反应动力学方程ln(POV/POV0)=-kt，对加热时间t和POV进行拟合，得到相关系数和回归方程，求得反应速率常数k。根据Arrhenius经验公式(lnk=lnk0-Ea/RT)，用lnk对1/T作图，得到一条斜率为-Ea/R的直线，由斜率求得表观活化能Ea[18,23]。同法空白参照。

1.3 统计方法及分析软件

指标均重复测定3次并取平均值，利用Ori gin8软件作图，应用SPSS20.0软件进行数据统计，用Duncan多重比较(SSR法)检验各处理平均数之间的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 鞣花酸磷脂复合物制备

2.1.1 单因素实验

投料比的确定：投料比对复合率有较大的影响，复合率随体系中磷脂比例的增加而增加。图1可知，在磷脂∶石榴皮鞣花酸质量比为3∶1时，磷脂复合物的复合率最高。说明当磷脂∶石榴皮鞣花酸质量比为3∶1时，二者的相互作用最充分。

鞣花酸浓度的确定：鞣花酸浓度对复合率有较大影响。因为鞣花酸在溶液中须经碰撞才能发生反应，合适的浓度有利于反应的进行[26]。鞣花酸浓度较小，二者相互作用不充分；鞣花酸浓度较大，鞣花酸在溶液中也不能完全碰撞发生反应。图1可知，在反应物浓度为1～5 mg/mL时，磷脂复合物的复合率随着鞣花酸浓度的增大而增大，当反应物浓度为5 mg/mL时，磷脂复合物的复合率最高。

反应时间的确定：反应时间对复合率有较大影响。反应时间过短，反应不完全；反应时间过长，微波的热效应会使鞣花酸产生降解。图1可知，在反应时间为20～30 min时，磷脂复合物的复合率逐渐增大，当反应30 min时，磷脂复合物的复合率最高。

微波功率的确定：超声-微波协同技术的最大优势在于能同时充分利用超声波的空化作用以及微波的高能作用和热效应。微波功率增加，鞣花酸和磷脂分子的热力学活动趋于活跃。但微波功率过大，微波的热效应会使鞣花酸产生降解；温度过高也不利于磷脂复合物的稳定。图1可知，在微波功率为200 W时，磷脂复合物的复合率达到最大值。

图1 鞣花酸磷脂复合物制备条件单因素实验结果

2.1.2 正交实验结果及分析

表1和表2分别为正交实验的因子与水平及结果。

表1 4因子在3水平正交实验的因子与水平

表2 正交实验设计及结果

表3 方差分析表

由表2极差R表明，影响复合率的因素主次依次排列为：鞣花酸质量浓度(A)>反应时间(C)>微波功率(D)>投料比(B)。由表3方差分析表明，对复合率的影响主次依次排列为：鞣花酸质量浓度(A)>反应时间(C)>微波功率(D)>投料比(B)。极差分析和方差分析在复合率影响主次排列上完全一致。表3还表明，鞣花酸质量浓度(A)和反应时间(C)对复合率的影响显著，其他则不显著。直观分析，实验的最优水平组合为A1B3C3D3；根据每个因素K1、K2、K3实验的最优水平组合为A1B2C3D3。因为投料比(B)1∶2与1∶3、1∶4差异显著，而投料比1∶3、1∶4之间差异不显著，综合分析提取成本和复合率，确定最佳工艺条件A1B2C3D3，即鞣花酸质量浓度3 mg/mL，投料比1∶3 g/g，反应时间35 min，微波功率300 W。因为最佳工艺条件A1B2C3D3在正交实验中未出现，因此根据最佳工艺条件进行工艺验证实验，平行3次，复合率分别为91.83%、91.79%、91.78%，平均91.80%，高于正交表中其他组合的复合率，由此证明正交实验结果准确可靠。

2.2 理化性质实验

2.2.1 光谱分析

紫外扫描如图2所示。卵磷脂没有共轭结构，卵磷脂只有在215 nm处有紫外最大吸收峰出现；鞣花酸在 265 nm、370 nm处有强烈吸收峰，这是由于鞣花酸具有共轭不饱和结构所致，与单书香[27]等学者研究结果较一致；鞣花酸磷脂复合物与鞣花酸在紫外图谱中没有显著差异，只不过鞣花酸和磷脂的复合，磷脂的极性基团与鞣花酸发生了较强的非共价键相互作用[28]，因此紫外吸收光谱特征有所改变，表现为最大吸收波长的少许位移。鞣花酸与卵磷脂在形成复合物的过程中仅仅是通过非共价结合，没有产生新的共轭结构。

图2 紫外吸收光谱图

图3 红外吸收光谱图

而卵磷脂具有羟基(3 358 cm-1)、亚甲基(2 926 cm-1)和羰基(1 740 cm-1)的特征吸收峰。鞣花酸和鞣花酸磷脂复合物的吸收光谱大致相同，复合物在扫描范围内吸收峰只出现少许位移并没有出现新的吸收峰。鞣花酸在 1 000 cm-1到 1 500 cm-1之间的大部分特征吸收特征峰变化比较大，表明鞣花酸和磷脂在形成复合物的过程中不是简单的一种混合状态，鞣花酸与卵磷脂通过非共价键发生了相互作用。

经光谱分析初步看出在复合物中并无新的化学键生成。从结构上看，磷脂带有正电性的季胺氮，鞣花酸酚羟基具有负电性的氧，两者可产生弱的偶极-偶极相互作用力而使两分子结合[30]，形成鞣花酸磷脂复合物。

2.2.2 溶解度测定结果

鞣花酸在25 ℃水中溶解度为 0.606 4 mg/mL；而鞣花酸卵磷脂复合物在水中的溶解度增加至0.849 2 mg/mL，水溶性增加了1.4倍。鞣花酸在 25 ℃正辛醇中的溶解度为 0.441 9 mg/mL；而鞣花酸卵磷脂复合物在正辛醇中的溶解度增加至0.917 9 mg/mL，脂溶性增加了2.1倍。相对槐花黄酮磷脂复合物对溶解性的影响(水溶性增加了19.1倍，脂溶性增加了6.4倍)[18]，鞣花酸磷脂复合物对溶解性的改善甚微，可能还是因为鞣花酸分子的刚性平面结构起了决定性的作用[5]。

2.3 石榴皮鞣花酸磷脂复合物对油样的抗氧化效果

2.3.1 浓度对石榴皮鞣花酸磷脂复合物抗油脂氧化效果的影响

图4表明，添加石榴皮鞣花酸磷脂复合物后，随着其添加量的增加，植物油的过氧化值逐渐降低，说明石榴皮鞣花酸磷脂复合物对葡萄籽油和核桃油具有抗氧化作用，且对葡萄籽油和核桃油的抗氧化能力有一定的量效关系。图4表明，抗油脂氧化效果最好的是0.06%石榴皮鞣花酸磷脂复合物，用以进行Schaal烘箱加速氧化实验。

图4 浓度对石榴皮鞣花酸抗油脂氧化效果影响

表4 植物油过氧化值的回归方程及活化能参数

2.3.2 温度对石榴皮鞣花酸磷脂复合物抗油脂氧化效果的影响

由图5可知，在45、55、65 ℃时，随着温度升高和加热时间的延长，植物油的过氧化值逐渐升高，氧化速度加快。鞣花酸磷脂复合物(EA-PC)、鞣花酸(EA)对葡萄籽油和核桃油的过氧化值变化趋势大体相同。

图5 植物油抗氧化稳定性在不同温度、时间下的变化

由表4可知，根据1.2.3.2方法得到过氧化值的回归方程，回归系数R>0.97，拟合度高。植物油的氧化反应属于一级反应，与其他学者的研究结果一致[23-25]。比较添加鞣花酸、鞣花酸复合物及空白对照的植物油的活化能，活化能的相对大小依次为：鞣花酸复合物(EA-PC)>鞣花酸(EA)>不添加，而且添加鞣花酸复合物比添加鞣花酸和不添加升高明显。说明添加石榴皮鞣花酸磷脂复合物能提高相应植物油的抗氧化性，实验结果与槐花黄酮磷脂复合物对植物油的抗氧化性影响相似[18]。其主要原因也是因为鞣花酸磷脂复合物所含可提供氢原子的酚类结构，中断自由基反应[31]。

表4同样表明，表观活化能增大百分率，核桃油比葡萄籽油增大明显，说明鞣花酸对核桃油的抗油脂氧化作用比葡萄籽油更好，实验结果与槐花黄酮磷脂复合物相似[18]。比较鞣花酸和槐花黄酮，鞣花酸对核桃油的抗油脂氧化作用比槐花黄酮更好。究其原因，核桃油与葡萄籽油含有不同的脂肪酸成分[32]，鞣花酸和槐花黄酮也有不同的酚类结构，当然还有含多不饱和脂肪酸油脂的氧化敏感性较高[32]等原因。

3 结论

以石榴皮鞣花酸为原料，以复合率为衡量指标，采用超声-微波协同技术，利用正交设计对制备鞣花酸磷脂复合物工艺条件进行优化。最佳制备工艺为：无水乙醇为反应溶剂，鞣花酸质量浓度3 mg/mL，磷脂与鞣花酸的投料质量比3∶1，反应时间35 min，微波功率300 W，此制备条件下，鞣花酸磷脂复合物复合率为91.80%。

光谱分析表明，鞣花酸与卵磷脂不是简单的一种混合状态，在形成复合物的过程中仅仅是通过非共价结合。磷脂复合物可改善鞣花酸的溶解性能，脂溶性增加了2.1倍，水溶性增加了1.4倍，改善溶解性能的效果不显著。

抗氧化实验结果表明，添加鞣花酸磷脂复合物后植物油的氧化符合一阶动力学反应。添加鞣花酸磷脂复合物后核桃油和葡萄籽油的氧化反应活化能都增大，核桃油表观活化能增大百分率比葡萄籽油大，鞣花酸磷脂复合物对核桃油的抗油脂氧化效果更好。