猫爪草多糖双氧水脱色工艺研究*

(安徽中医药高等专科学校药学系，芜湖 241000)

猫爪草为毛莨科植物小毛莨的块根，具有调免疫、抗肿瘤、抗氧化等作用[1-2]，免疫活性部位的筛选试验表明多糖是其重要活性成分之一。采用水提醇沉法所得的猫爪草粗多糖中含有大量色素，需进一步精制纯化。基于此，本文探讨了双氧水脱除猫爪草多糖色素的工艺条件，并利用正交试验进行优化，以期为猫爪草多糖的脱色处理提供参考。报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

猫爪草购于安徽亳州中药材市场，经安徽中医药高等专科学校汪荣斌教授鉴定为毛莨科植物小毛莨的块根；FA1204N型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；RE5298A旋转蒸发仪(西安禾普生物科技有限公司)；80-2B离心机(湖南星科科学仪器有限公司)；UV-1800型紫外可见分光光度计(上海翱艺仪器有限公司)；苯酚、无水乙醇、双氧水(质量浓度30%)等试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1猫爪草多糖的制备 将猫爪草粉碎后用石油醚回流脱脂3次，每次6h。而后加20倍量水，于90℃提取2次，每次2h。合并上清液并减压浓缩，加4倍体积无水乙醇，冷藏过夜。收集沉淀得猫爪草粗多糖。用蒸馏水溶解至1.0mg/ml，作待脱色液备用。

1.2.2多糖含量测定-苯酚硫酸法 具体方法参见文献[3]。

1.2.3多糖保留率与色素脱除率的计算

(1)

(2)

式1中，M1示脱色之前多糖质量，M2示脱色之后多糖质量。式2中，A1示脱色处理之前溶液450 nm处的吸光度，A2示脱色处理之后溶液450 nm处的吸光度。

1.2.4单因素试验 取50ml待脱色液5份，以脱色率及多糖保留率为指标，考察脱色时间(20、40、60、80、100min)、脱色pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、脱色温度(35℃、45℃、55℃、65℃、75℃)、双氧水用量(5%、10%、15%、20%、25%)4个因素对猫爪草多糖脱色效果的影响。

1.2.5正交试验 根据单因素试验结果，固定pH 9.0，以多糖脱色率为考察指标，选择脱色时间(A)、脱色温度(B)、双氧水用量(C)进行三因素三水平正交试验，优化猫爪草多糖脱色工艺，各因素水平安排如表1所示。

表1 正交试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 脱色时间对猫爪草多糖脱色效果的影响

在20～60min的脱色时间范围内，随着时间的延长，猫爪草多糖脱色率迅速从45.4%提高至78.9%。但60 min以后，脱色率变化较小。而多糖保留率随脱色时间的延长不断降低，且60min后降低速度加快。可能原因是双氧水氧化色素同时也在氧化多糖，脱色时间越长多糖损失越多。因此，应选择脱色时间为60min较为适宜。见图1。

2.2 脱色pH对猫爪草多糖脱色效果的影响

猫爪草多糖的脱色率随pH值的升高而逐渐提高。pH 6.0时，脱色率64.1%，pH 9.0时，脱色率78.3%。此后继续增加pH至10.0时，脱色率几乎保持不变。H2O2在水溶液中可电离出过氧氢根离子攻击色素，且在碱性介质中其电离度增大。因此，提高pH可增强双氧水的脱色作用。多糖保留率则受pH影响较小，稳定在71.9%～75.1%之间，故应选择pH为9.0较为适宜。见图2。

图1 脱色时间对猫爪草多糖脱色效果的影响

图2 脱色pH对猫爪草多糖脱色效果的影响

2.3 脱色温度对猫爪草多糖脱色效果的影响

提高温度可增加脱色率，因为高温可加快自由基的离解，利于脱色。所以当温度从35℃升高至55℃时，脱色率提高了1.2倍，达到78.2%。但过高的温度同时也会促进自由基自身的分解，不利于脱色。所以，当温度超过55℃后，脱色率开始降低。与此同时，多糖保留率几乎不变，所以，综合考虑应选择脱色温度为55℃。见图3。

图3 脱色温度对猫爪草多糖脱色效果的影响

2.4 双氧水用量对猫爪草多糖脱色效果的影响

当双氧水用量5%时，脱色率40.8%，而双氧水用量20%时，脱色率78.2%，提高了1.9倍。主要原因是当双氧水浓度较低时，分解速度较慢，因而脱色效果相对较差。但继续增加双氧水的用量，脱色率变化不大，与此同时多糖保留率迅速降低，因过量的双氧水会导致多糖的氧化降解。因此，应选择双氧水的用量为20%较为适宜。

图4 双氧水用量对猫爪草多糖脱色效果的影响

2.5 正交试验结果

正交试验结果及方差分析如表2、3所示，可知对猫爪草多糖双氧水脱色率影响大小的顺序为：双氧水用量>脱色时间>脱色温度 ，但三个因素中只有双氧水用量对猫爪草多糖脱色率影响显著(P<0.05)。最优工艺组合为A1B1C3，即脱色时间60 min、脱色温度45 ℃、双氧水用量25%。但由单因素考察可知，双氧水用量达25%时，多糖保留率降低，因此,综合考虑脱色率与多糖保留率，选择双氧水用量为20%。

表2 正交试验设计及结果

表3 正交试验方差分析结果

为验证双氧水脱色工艺的稳定性和可信度，在最优条件下进行3次平行试验。见表4。

表4 验证试验结果

3组平行试验结果稳定，重现性较好，且多糖保留率相对较高，表明该脱色工艺稳定可行。

3 讨论

目前，常用的多糖脱色方法包括吸附法、化学法、离子交换法等。龚敏等[5]采用大孔树脂对药桑多糖脱色后发现其抗氧化活性有所增强；蒋俊等[6]报道了猴头菌大孔树脂脱色多糖对胃黏膜的损伤修复作用显著提高；但肖平等[7]用活性炭对板蓝根多糖脱色后发现其清除自由基的能力降低。因此，脱色方法的选择除考虑脱色率、多糖保留率以外，还应评估其对多糖结构与活性的影响。

本文采用双氧水对猫爪草多糖进行脱色，考察了脱色时间、pH、脱色温度、双氧水用量对脱色率及多糖保留率的影响，并通过正交试验对工艺进行了优化。结果表明，双氧水用量对脱色率有显著影响，在脱色时间60 min、pH 9.0、脱色温度45℃、双氧水用量20%的条件下，猫爪草多糖的双氧水脱色率为79.7%，多糖保留率为74.3%。但双氧水为强氧化剂，从单因素考察可知其可能导致多糖氧化降解，故下一步将结合多糖的结构分析与活性研究，更为深入地探讨双氧水的脱色影响。