微生物发酵法提升饲用大米蛋白粉品质的工艺优化研究

龙 祝 胡 佳 杨庆金 方 莹 郭小华

(中南民族大学生命科学学院，武汉 430074)

大米蛋白粉是稻米加工淀粉后的副产物，过滤掉大米浆液后，剩下的残渣中的蛋白质含量高达50%(干基)以上[1]。作为一种低过敏性的植物高蛋白来源，大米蛋白粉与豆粕、棉粕和菜粕不同，自身不含抗营养因子、激素和其他有毒成分，是一种安全、卫生、环保和绿色的材料[2]。大米蛋白具有良好的氨基酸组成配比，其饲用品质要优于小麦蛋白和玉米蛋白，必需氨基酸组成的配比与WHO 1973年认定的蛋白质最佳氨基酸配比模式最为符合[3]。目前已有较多的研究证明了大米蛋白粉的饲用价值，付京花等[4]在凡纳滨对虾日粮中使用大米蛋白替代鱼粉，发现60%的鱼粉被大米蛋白替代后对对虾的生长无显著影响。Oujifard等[5]的研究结果也表明，南美白对虾日粮中大米蛋白浓缩物可以有效代替达50%的鱼粉。大米蛋白粉的饲用开发既可以提高稻谷的附加值，更能有效替代鱼粉，从而能减少饲料日粮中对鱼粉蛋白的依赖，大大降低饲料配方成本。

本研究尝试利用有益微生物采用固态发酵的方法对大米蛋白粉进行处理，拟提高蛋白水解率和酸溶蛋白含量，增加饲用营养价值，为生产质量更高的优质蛋白饲料源提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

采用3种常见的有益微生物发酵剂，分别是：BacillusamyloliquefaciensBS-20(以下简称BS-20)、LactobacillusreuteriC5(以下简称C5)、SaccharomycescerevisiaeSC18(以下简称SC18)，菌株均为实验室自行分离鉴定并评估具有良好益生菌潜力。菌种保存于-80 ℃下含20%甘油的冻存管中。

1.2 培养基

种子培养基：芽孢杆菌培养用LB培养基(蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、氯化钠5 g/L)；酵母菌培养用YPD培养基(蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖20 g/L)；乳酸菌培养用MRS培养基(蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉5 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、吐温80 1 mL/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L)。

固态发酵基质：以大米蛋白粉、麸皮(均为市售)按照一定比例混合作为固体组分；液体组分中含有葡萄糖8 g/L、蛋白胨2 g/L、硫酸锰0.001 mol/L。发酵基质以固态组分和液体组分根据实验需要按照一定比例混合形成一定的初始含水量。

1.3 主要仪器

K-360 BUCHI凯氏定氮仪，V-5600可见光分光光度计，SPX智能型生化培养箱，SX-500型自动高压灭菌锅。

1.4 发酵剂的制备

BS-20从斜面刮取一接种环于含有50 mLLB液态培养基的三角瓶中，放入37 ℃摇床培养箱中200 r/min隔夜培养；C5从含有15%甘油保存的厌氧管中接种1%于50 mLMRS培养基中，放入37 ℃静置培养箱中隔夜培养，SC18从斜面刮取一接种环于含有50 mLYPD液态培养基的三角瓶中，放入30 ℃摇床培养箱中200 r/min隔夜培养。

1.5 发酵底物的处理

称取一定量的大米蛋白粉和麸皮按照一定配比混合置于250 mL的三角瓶中，总装样量为30 g，加入液体组分混合均匀后置于灭菌锅中115 ℃灭菌处理20 min，待凉至室温后于超净工作台中接入新鲜的发酵剂，混合均匀后置于37 ℃培养箱中培养。每间隔一段时间摇动拍打三角烧瓶，使均匀发酵。

1.6 单因素实验

1.6.1 固态基质中初始大米蛋白粉含量对发酵的影响

固态发酵基质采用在大米蛋白粉中加入麸皮来促进发酵基质疏松度，初始大米蛋白粉的含量分别是90%、80%、70%、60%，按照10%的接种量(以固态基质总量计)接种单一芽孢杆菌BS-20，补加液体组分使固态基质初始含水量均为53%，在37 ℃恒温箱中培养48 h，测定发酵基质中酸溶蛋白的含量。同时分别测定每个固态基质中初始的酸溶蛋白水平，计算发酵前后基质中酸溶蛋白的增加量。

1.6.2 初始含水量对发酵的影响

以1.6.1中优化的初始大米蛋白粉含量为基础，根据固液混合比例的不同设置发酵基质中不同的初始含水量水平分别为44%、47%、50%、53%，其余条件同1.6.1,测定发酵完成后固态基质中酸溶蛋白的含量。

1.6.3 不同菌株组合对发酵效果的影响

以1.6.2中优化的合适初始含水量为基础，以接种10%单一的芽孢杆菌BS-20单菌株发酵为对照，在保持初始含水量一致的条件下，分别接种乳酸杆菌(即5%的BS-20+5%的C5)、酵母菌(即5%的BS-20+5%的SC18)以及三种复合发酵剂(即3.4%的BS-20+3.3%的C5+3.3%的SC18)，其余条件同1.6.2，测定发酵完成后固态基质中酸溶蛋白的含量。

1.6.4 发酵时间对发酵的影响

以1.6.3中优化的菌株组合为基础，固态基质在采用不同的发酵时间，即分别24、36、48、60、72、84、96、108、120 h时取样测定基质中酸溶蛋白的含量。

1.7 Box-Behnken实验

利用JMP11.0进行响应面设计，对单因素实验中筛选出的对发酵影响较显著的三个因子设计三水平的Box-Behnken中心复合实验，测定各组实验固态基质中酸溶蛋白含量并作为响应值，共设计15组实验，其中3个中心点重复实验，实验设计因素水平及编码见表1，实验设计见表2。

1.8 固态发酵优化的结果验证

根据响应面优化的发酵条件进行实际重复发酵实验，对发酵前后固态基质中中粗蛋白和酸溶蛋白含量进行定量检测，比较发酵前后大米蛋白粉中粗蛋白和酸溶蛋白含量的变化情况。

1.9 分析方法

发酵优化实验中，固态基质中的酸溶蛋白采用三氯乙酸法，即取一定量固体发酵后的样品经无菌生理盐水10倍稀释，充分震荡混匀后静置，6 000r/min离心5 min得到上清液，取一定量上清液与10%三氯乙酸1∶1反应2 h，离心取上清，采用福林酚法检测上清中可溶于三氯乙酸中的蛋白质浓度[6]。

在发酵验证实验中，粗蛋白和酸溶蛋白含量的定量检测分别参照GB/T 22492—2008中大豆肽粉酸溶蛋白含量的测定[7]及GB/T 6432—2018中饲料中粗蛋白的测定全量凯氏定氮法[8]进行操作及计算，即分别对发酵前后的样品真空干燥后，用研钵磨成粉末状，再按照国标中的检测方法来分别进行测定。

1.10 数据处理

本实验中每个实验均是基于3个平行实验的结果，统计结果以3个平行结果的均值±标准差的形式来表示；单因素实验均采用Origin9.1进行数据分析，采用One-Way ANOVA程序对数据进行单因素方差分析，用Duncan氏法进行多重比较检验，P<0.05表明数据差异性显著。Box-Behnken实验用JMP11.0进行响应面拟合模型设计和统计分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素条件确定

2.1.1 初始大米蛋白粉含量对发酵效果的影响

固态发酵中添加麸皮一方面可以降低大米蛋白粉的黏度，增加物料的通气性，另外还能改善培养基的营养，弥补固态基质中碳源的不足[9]。本实验添加麸皮后不同的大米蛋白粉含量对发酵效果的影响结果如图1所示，当大米蛋白粉质量分数为80%和70%时，酸溶蛋白含量较高。当大米蛋白粉质量分数为70%时，酸溶蛋白增加最多。过高的初始大米蛋白粉添加会降低发酵基质中的疏松度，不利于好氧性芽孢杆菌的增殖代谢，减少酸溶蛋白的积累；而当添加的麸皮含量进一步提高时，固态基质中酸溶蛋白增加量有所降低，这可能是过多的麸皮改变了基质的C/N比值，降低了培养基中的营养成分，不利于芽孢杆菌的生长代谢[10]。因此，本实验选择初始大米蛋白粉含量为70%进行下一步实验。

图1 初始大米蛋白含量对发酵效果的影响

2.1.2 培养基含水量、不同菌株组合、发酵时间对发酵效果的影响

基质含水量对固态发酵过程具有重要影响，这可能是由于高水分含量会形成低的基质孔隙率而导致氧气转移的减少，而低的水分含量可能会导致营养物质扩散不良[11]。培养基中含水量对发酵效果的影响如图2所示，结果表明，在含水量从44%增加至50%时，酸溶蛋白水平随含水量的增加而增加，当含水量达到50%时，酸溶蛋白水平达到最大；当含水量进一步增加时酸溶蛋白含量反而显著降低，这可能是因为过多的水分降低了固态基质的疏松性，导致了芽孢杆菌生长环境中溶解氧的降低。此结果与张连忠等[12]的研究固态发酵时含水量在50%～60%较为适宜相一致。最终选择含水量为50%进行下一步实验。

复合菌株进行协同发酵可发挥不同微生物之间的协同性和互补性，总体上对发酵效果产生良好的影响[13]。本研究尝试在芽孢杆菌BS-20单菌株发酵的基础上添加酵母菌SC18和乳酸菌C5来提高发酵基质中酸溶蛋白的水平。结果发现，在芽孢杆菌BS-20进行单菌株发酵时，发酵基质中的酸溶蛋白含量反而最高，其他添加了酵母菌SC18和乳酸菌C5的处理组中酸溶蛋白的含量都显著降低(图2)。这可能是由于不同的菌株在同一基质中生长存在拮抗作用，酵母菌及乳酸菌的接入抑制了芽孢杆菌的生长，降低了对大米蛋白中大分子蛋白的降解效果[14]。刘雪花[15]研究证明混菌株发酵豆粕与单菌株相比酸溶蛋白含量反而有所下降。进行单菌株发酵还能简化生产工艺，大幅度降低工业生产成本。最终选择芽孢杆菌BS-20单菌株发酵进行下一步实验。

发酵时间是固态发酵过程中非常重要的一个环节，适宜的发酵时间可以得到最大的酸溶蛋白得率[16]。本实验中发酵时间对发酵产酸溶蛋白水平的影响结果如图2所示，时间从24～84 h时，酸溶蛋白含量持续有较大增幅，从40 mg/g增至180 mg/g左右，且在发酵时间为84 h时含量达到最高。继续延长发酵时间，固态基质中酸溶蛋白含量不再增加，说明芽孢杆菌在发酵周期内其代谢能力已经释放完全。在固态发酵生产过程中，更短的发酵时间能减少成本与能源的消耗。发酵时间过长一方面增加发酵成本，另一方面增加污染的可能性，影响产品的品质。故大米蛋白粉发酵时间选择84 h左右效果较好。

图2 培养基含水量、不同菌株组合、发酵时间对发酵效果的影响

2.2 Box-Behnken实验结果

从上述单因素实验结果可知，大米蛋白粉含量、含水量和发酵时间对发酵效果有显著影响，以大米蛋白粉质量分数为70%、含水量50%、发酵时间84 h为中心点，固态基质中酸溶蛋白含量为响应值进行响应面优化。实验因素水平及编码如表1所示，其相应的实验设计及结果见表2。使用软件JMP11对实验数据进行多元回归分析，得到二次多项响应面回归模型：

根据方差分析结果(表3)可知，R2=0.931 3，P值为0.019 3，表明该模型拟合良好且回归显著，由F值可知，各因子贡献率X3>X2>X1，即对发酵效果影响因子主次顺序为：发酵时间>含水量>大米蛋白含量。

表1 实验因素水平与编码表

表2 响应面实验设计与结果

表3 响应面模型的方差分析

由响应面实验结果可知，大米蛋白含量、含水量和发酵时间具有显著的交互作用。当大米蛋白质量分数为70%、含水量52%、发酵时间为87 h时，酸溶蛋白含量有最大值为175.63 mg/g。

2.3 固态发酵优化的结果验证

酸溶蛋白由小分子肽和游离氨基酸组成，能被动物肠道直接消化吸收利用，其含量的高低反应出原料中大分子蛋白被降解的情况，决定了大米蛋白经发酵处理后的品质高低[17]。本实验中大米蛋白粉经微生物发酵后，由于所用解淀粉芽孢杆菌具有良好的产酶特性[18]，将大米蛋白粉中大部分原本难以被直接利用的大分子蛋白降解成小分子蛋白和肽类，发酵产物中酸溶蛋白的含量大幅度提高，使得大米蛋白粉的营养和功能特性得到了大幅度的改善。其验证结果如表4所示。

发酵后基质中粗蛋白含量也有一定的增加。一方面可能是由于微生物具有利用大米蛋白粉中营养物质，降解纤维素合成自身菌体蛋白的能力[19]。另一方面有可能是由于发酵过程中微生物能够利用物料中的糖分，使得发酵后物料的总质量减少从而间接提高粗蛋白的含量[20]。

表4 发酵前后基质中粗蛋白和酸溶蛋白含量的变化

3 结论

本实验为大米蛋白粉的开发利用提供了一种工艺条件：在大米蛋白粉添加量为70%，添加水分达到52%时，采用单菌株BacillusamyloliquefaciensBS-20按照10%的接种量接种发酵，发酵时间87 h。在此条件下发酵后的产物中酸溶蛋白含量达到40.5%，与发酵前相比提高率为128.7%，产物中粗蛋白含量达到59.5%,与发酵前相比提高率为12.5%。此发酵工艺条件使得大米蛋白粉的营养成分得到较大提高，大幅度提升了饲用大米蛋白粉的品质。