黑豆皮乙醇提取物对大米淀粉理化性质及回生性质的影响

王存堂 高增明 张福娟 姜辰昊 孟庆怡

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院1，齐齐哈尔 161006)(朝阳师范高等专科学校生化工程系2，朝阳 122000)

大米是世界主要的粮食作物之一，也是我国和东南亚国家的主食之一，大米及其产品具有很大的商业潜力[1]。大米淀粉颗粒较小、质地细腻、大米淀粉糊化后吸水快、容易分散涂抹，且过敏性较低，因此，大米及其淀粉在方便食品、化妆品、婴儿食品及功能性食品基料等方面用途广泛[2]。由于大米及其制品在储存过程中淀粉回生率很高，易出现硬度增加、水分减少等回生现象，导致其口感劣变、保质期缩短，成为制约大米及其米制品工业发展的一个重要问题。因此，如何调控大米及其淀粉制品的回生特性，成为大米及其淀粉制品加工及贮藏过程中的关键所在。

大米淀粉的回生过程是糊化后的淀粉分子从杂乱无序的分子状态通过重结晶过程逐渐转变为有序结晶状态的过程[3]，因此可以通过调控淀粉分子之间相互作用过程，实现延缓大米淀粉回生的目的。目前，植物多酚类物质常被作为一种天然的抗氧化剂添加到淀粉质食品中，研究发现植物多酚类物质能抑制淀粉的回生进程，其影响淀粉回生的原因较多，如淀粉来源、多酚结构以及多酚的添加量等，如绿茶多酚提取物可显著抑制大米和马铃薯淀粉的回生[4]，而黑茶多酚能显著抑制蜡质大米淀粉和大米淀粉的回生，但对马铃薯淀粉的糊化和回生特性无明显影响[5]，原花青素可抑制大米淀粉的回生[6]，葡萄籽提取物可抑制蜡质玉米淀粉的回生[7]，然而，芦丁和槲皮素对小麦淀粉的回生进程却具有促进作用[8]。黑豆皮中富含花色苷类成分，具有降血压、降血脂、降血糖、抑制肥胖和抗氧化及清除自由基等多种生理活性[9]，其乙醇提取物中花色苷含量为26.9%，其主要成分是矢车菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芍药色素-3-O-葡萄糖苷等[10]。但是黑豆皮花色苷类物质对大米淀粉理化性质和回生性质的影响鲜见报道。因此，本研究将黑豆皮乙醇提取物(Ethanol Extract of Black Soybean Coats, EBSC)添加到大米淀粉中，通过分析大米淀粉的透明度、老化度、溶解度、膨胀度以及凝胶强度的变化，探讨EBSC对大米淀粉理化性质的影响；采用差式扫描量仪(DSC)测定其糊化和回生的热力学性质，评价EBSC对大米淀粉回生的影响，同时分析了EBSC对大米淀粉体外消化性能的影响，从而为黑豆皮花色苷类物质在大米及其淀粉制品中的广泛应用，开发出更多新颖、营养健康的大米及其淀粉类产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑豆皮取自齐齐哈尔市浏园市场；大米淀粉(含水量14.62%)；糖化酶(100 000 U/g)、猪胰α淀粉酶(20 000 U/mL，)、氢氧化钠、乙酸、乙醇、无水乙酸钠、重苯酚、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、亚硫酸钠均为分析纯。

2L-ARE旋转蒸发器，GX-220高速不锈钢多功能粉碎机，UPG-722可见分光光度计，C-LM型数显式剪切力仪，2.5LfreezePrysystem真空冷冻干燥机，STA449F3同步热分析仪。

1.2 方法

1.2.1 EBSC制备

取粉碎的黑豆皮100 g，然后加入70%乙醇200 mL，在25 ℃下浸提2 h，然后将浸提液经6 000 r/min的离心处理，取上清液备用。离心后的沉渣再次经过浸提、离心处理，合并2次离心上清液。将合并后的提取液在旋转蒸发器中真空浓缩(50 ℃)，再将浓缩液冷冻干燥即为EBSC(得率为10.28%，总酚含量42.12%)，将EBSC储存于-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 大米淀粉透明度测定

取大米淀粉 1.0 g，加入占大米淀粉质量分别为0%、1%、2.5%、5.0%、10.0%的EBSC进行混合，然后加入100 mL去离子水配制成大米淀粉-EBSC混合溶液， 90 ℃水浴加热30 min，随即冷却到20 ℃，振荡器摇匀，在620 nm处测定吸光度值，并将样品在4 ℃下分别冷藏1、3、5、7 d后，将样品摇匀后在620 nm处测定淀粉溶液的吸光度值，并用去离子水做空白[11]。

1.2.3 大米淀粉溶解度、膨胀度测定

取大米淀粉 1.0 g，加入占大米淀粉质量分别为0%、1%、2.5%、5.0%、10.0%的EBSC进行混合，然后加入100 mL去离子水配制成大米淀粉-EBSC混合溶液，在90 ℃下加热30 min，然后冷却到室温，在4 000 r/min离心10 min，将上清液倒入培养皿中在水浴锅上蒸干，并在105 ℃烘箱中烘干至恒重。称取被溶解淀粉的质量记为A，按式(1)计算淀粉的溶解度S，离心管剩余淀粉糊的质量计为P，按式(2)计算淀粉的膨胀度B[11]。

淀粉溶解度S=A/W×100%

(1)

淀粉膨胀度B=P/[W(1-S)]100%

(2)

1.2.4 大米淀粉老化度测定

取大米淀粉 1.0 g，加入占大米淀粉质量分别为0%、1%、2.5%、5.0%、10.0%的EBSC进行混合，然后加入100 mL去离子水配制成大米淀粉-EBSC混合溶液，在90 ℃下加热30 min，然后冷却到室温，将其分装到离心管中，并在4 ℃下静置冷藏1、3、5、7 d后，记录上清液的体积[11]。

淀粉老化度=(上清液体积/淀粉糊总体积)×100%

(3)

1.2.5 大米淀粉凝胶硬度测定

按照廖卢艳等[12]的方法并做修改。准确称量20 g 大米淀粉，分别加入占大米淀粉质量的0、1%、2.5%、5.0%、10.0%的EBSC进行混合，再加入25 mL去离子水配制成淀粉溶液，在90 ℃下加热30 min使其糊化，冷却至室温后，装进 10 mL 的注射器中冷却，并在4 ℃下冷藏1、3、5、7 d后，形成直径为 1.5 cm 的圆柱形凝胶。测试前将凝胶倒出切成直径为 1.5 cm 高 2 cm 的小圆柱形体在CL-M型剪切力仪上进行凝胶硬度测定，凝胶柱被切断时所受的力的大小(N)即为凝胶硬度。此值越大，说明凝胶硬度越大。

1.2.6 大米淀粉回生样品的制备

取大米淀粉 10 g，分别加入占淀粉干质量0%、1.0%、2.5%、5%、10%的EBSC混合，并加入20 mL水后在121 ℃下糊化20 min。将糊化后样品放入4 ℃冰箱内贮存15 d后，将样品冻干后研磨，过120目筛后，备用。

1.2.7 糊化和回生大米淀粉的热力学性质测定

采用差式扫描量热仪法(DSC)对糊化和回生大米淀粉的热力学性质进行测定[6]。分别添加0%、1%、2.5%、5%及10%(占大米淀粉干质量)的EBSC于大米淀粉中。称取2 mg EBSC-大米淀粉混合样品加入PE坩埚中，按1∶2(m∶m)比例加入去离子水。将混合样品密封后，在4 ℃条件下静置24 h后在DSC上进行糊化焓值测定。测定条件如下：以10 ℃/min的速度从30 ℃升温到120 ℃，以空坩埚作对照，氮气为载气，气流流速为20 mL/min。根据糊化温度曲线，可以确定出淀粉糊化过程中的起始温度(To)、峰值温度(Tp)、终止温度(Tc)和糊化焓值(ΔHg)。然后测定1.2.6中EBSC-大米淀粉混合物回生样品的起始温度(To)、峰值温度(Tp)、终止温度(Tc)和回生焓值(ΔHr)，升温程序与测定条件和测定糊化焓值的相同，根据回生温度曲线可以确定并计算样品的回生率DR，即相同EBSC添加量的大米淀粉的回生焓和糊化焓的比值，DR=(ΔHr/ΔHg)×100%。

1.2.8 回生大米淀粉的体外消化性能测定

根据Englyst法进行大米淀粉体外消化实验，分别配制含0%、1%、2.5%、5%、10%EBSC的大米淀粉混合样品。取100 mg 样品，加入25 mL乙酸钠缓冲液(pH5.2)，振荡混匀后加入 5 mL 混合酶溶液(20 000 U/mL猪胰腺 α-淀粉酶与10 000 U/mLα-葡萄糖苷酶)。在气浴(37 ℃)条件下振荡反应，当反应 20、120 min 时分别取出反应液 1 mL，随机灭酶处理(加入 5 mL 95%的乙醇)，然后离心处理(5 000 r/min，10 min)。取1 mL 离心上清液，加入 DNS 溶液 2 mL后沸水浴 5 min，随即定容至 15 mL，在 520 nm处测其吸光度值。以葡萄糖为标准品，做标准曲线，方程式为y=1.613 4x-0.083 2，R2=0.999 1，根据葡萄糖标准曲线计算淀粉在20、120min生成还原糖的含量[13]。

快消化淀粉(RDS)=[(G20-FG)/TS]0.9×100%

(4)

慢消化淀粉(SDS)=[(G120-G20)/TS]0.9×100%

(5)

抗性淀粉(RS)=[(TS-G120)/TS]×0.9×100%

(6)

式中：G20为酶水解20 min后产生的葡萄糖质量/mg；FG为酶水解处理前淀粉中游离葡萄糖质量/mg；G120为酶水解120 min后产生的葡萄糖质量/mg；TS为样品中总淀粉质量。

1.3 数据处理

所有实验均3次重复，结果表示为平均值±标准偏差。采用SPSS25.0软件对数据进行方差分析，并进行Duncan’s差异显著性分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 EBSC对大米淀粉透明度的影响

淀粉的透明度代表了淀粉分子与水分子的结合能力，由于淀粉与水共热的条件下，淀粉分子吸水膨胀，支链和直链分子不断进行氢键之间的交联作用，交联程度越大透明度越低，反之缔合程度越小，透明度越高[14]。同时随着储藏时间的延长，淀粉回生程度的增加也会导致淀粉透明度下降。

由图1可知，随着储藏时间的延长，添加不同量的EBSC淀粉的透明度逐渐下降。当EBSC的添加量为2.5%，大米淀粉透明度的增加幅度最大，但添加10%EBSC对淀粉透明度的抑制效果不如添加量为2.5%EBSC的淀粉，可能的原因是提取物中多酚类物质的多羟基结构可以阻碍淀粉分子之间的交联，从而使得淀粉分子不能形成有序的排列，导致透明度的上升。而过量的提取物除了与淀粉分子结合干扰其内部重组，剩余的提取物则游离在淀粉糊的周围阻碍了光线的传递，导致其透明度有所下降。淀粉来源、多酚结构的差异以及多酚的添加量对淀粉透明度的影响差异很大。花青素和儿茶素加入蜡质玉米淀粉，可导致淀粉糊透明度显著增加[11]，苦荞多酚的添加可导致荞麦淀粉和小麦淀粉的透光率显著下降[8]，而在蜡质玉米淀粉中添加咖啡酸、绿原酸、没食子酸以及单宁酸，则淀粉糊的透明度变化不显著[11]。

注：不同小写字母为同一处理组的不同回生时间之间差异显著(P<0.05)，不同大写字母为不同处理组之间差异显著(P<0.05)。图1 EBSC的添加量对大米淀粉透明度的影响

2.2 EBSC对大米淀粉溶解度和膨胀度的影响

淀粉的溶解度和膨胀度是淀粉与水在加热的条件下最基本的物理性质之一，可以通过溶解度和膨胀度的大小来直观判断淀粉与水之间相互作用力的强弱。淀粉在常温下不溶于水，但是淀粉在受热时，直链淀粉析出和水分子不断形成氢键，淀粉开始少量溶解，随着加热时间的延长，未溶解的淀粉开始吸水膨胀，分子内部的作用力不断减小，膨胀度增大[11]。由图2可知，EBSC可显著提高大米淀粉的溶解度和膨胀度，与对照组相比，添加10%EBSC的大米淀粉溶解度和膨胀度分别提高了约2.7倍和2倍。这可能是因为EBSC中羟基基团能够进入到淀粉分子的内部，从而产生一定的空间位阻，导致直链、支链淀粉的大量析出，溶解度增大，同时阻碍了淀粉分子之间的聚合力，使其内部结构变得蓬松，从而膨胀度增大[15]。然而也有研究发现，单宁酸、原花青素、咖啡酸、儿茶素、绿原酸和阿魏酸均能减小玉米淀粉的溶解度和膨胀度[11]。由此可见，由于淀粉来源和多酚结构以及多酚的添加量的不同，对淀粉溶解度和膨胀度的影响差异很大。

注：不同小写字母为不同处理组之间差异显著(P<0.05)。图2 EBSC的添加量对大米淀粉溶解度和膨胀度的影响

2.3 EBSC对大米淀粉老化度的影响

淀粉的老化度可以用淀粉的持水能力大小来表示。糊化后的淀粉分子在冷却的过程中，处于无序状态的分子与分子之间开始互相碰撞、结合，而在分子结合成有序状态的过程中促使水分析出，从而导致淀粉的持水能力下降。当淀粉析出的水分越多时，则表明淀粉的持水能力越小，也即淀粉的老化程度越大[13]。

由图3可以看出，随着储存时间的延长，大米淀粉的老化度逐渐升高，代表淀粉的回生程度加大。与对照组相比，在淀粉中添加不同添加量的EBSC对淀粉的老化度有一定的抑制作用，添加量为2.5%时，抑制效果最为显著。此外，随着储存时间的延长，添加不同添加量的EBSC淀粉的老化速率也有一定的减缓。可能的原因是多酚类化合物具有多羟基结构，可与淀粉分子形成氢键，从而阻碍了淀粉分子之间氢键的形成，抑制多酚淀粉老化的进程[5]。研究发现，绿茶提取物可以降低大米、玉米和马铃薯淀粉的老化进程，而且绿茶提取物对大米淀粉和玉米淀粉的老化抑制效果优于马铃薯淀粉[4]，柑橘黄酮(柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷)可以延缓玉米淀粉的老化进程[16]，而芦丁或槲皮素则加快了小麦淀粉老化进程[17]。由此可见，植物多酚类物质对淀粉的老化的影响因素较为复杂，淀粉来源、植物多酚结构以及多酚的添加量等均对淀粉老化度的影响较大。

2.4 EBSC对回生大米淀粉凝胶强度的影响

淀粉回生过程中硬度变化是淀粉类食物最主要的感官特性之一，因此也是淀粉类食品最重要的评价指标之一[11]。淀粉类食物在贮存过程中，老化程度加剧导致淀粉类食品的硬度增加，口感变差。淀粉糊化后在冷却的过程中，分子内部相互交缠形成一个三维的网络结构的凝胶状态，其具有一定的硬度[18]。

从图4可知，在贮存过程中，大米淀粉凝胶强度呈总体升高的趋势，且当回生时间相同时，随着EBSC添加量的增加而显著降低(P<0.05)。由于淀粉回生过程中，淀粉分子内部的支链分子外侧无数的分支结构逐渐缠绕形成结晶区，从而导致淀粉分子凝胶强度的增大[18]。而加入EBSC后，对淀粉回生过程中凝胶强度的增大有一定的抑制作用，说明添加EBSC对大米淀粉分子内部微晶束的形成有一定的干扰作用，破坏了淀粉分子内部凝胶网络的形成。相似地，有研究表明芦丁或槲皮素的添加可降低小麦淀粉的凝胶硬度[17]，同时茶多酚也可以导致甘薯淀粉的凝胶硬度显著下降[19]。

图4 EBSC的添加量对大米淀粉凝胶强度的影响

2.5 EBSC对大米淀粉糊化热力学性质的影响

淀粉糊化的熔融焓值代表在与水共热的条件下，解开淀粉分子中双螺旋结构能量的大小，其本质是亲水性的羟基基团与支链淀粉的侧链相互作用，并在不同程度上结合到淀粉颗粒的无定形区域，从而改变结晶区和无定形基质之间的耦合力[11]。由表1可以看出添加不同添加量的EBSC淀粉的糊化起始温度(T0)和糊化焓值(ΔH)与对照组相比均有下降的趋势。植物多酚类物质，如原花青素、苦荞多酚等含有较多羟基，容易与淀粉的侧链发生相互作用，能在一定程度上促进淀粉的糊化[6, 8]。这被认为是由于多酚的羟基，并与淀粉的非结晶区域发生不同程度的结合，从而改变晶体与非晶体之间的耦合矩阵，使得淀粉在糊化时所需的能量减小[1]。

表1 黑豆皮乙醇提取物添加量对大米淀粉糊化热力学特性影响

2.6 EBSC对回生大米淀粉热力学性质的影响

在低温条件下贮存时，糊化后淀粉分子之间可以形成以氢键结合的晶体聚合物[21]。淀粉回生焓值(ΔHr)则是指当淀粉晶体聚合物发生熔融时所需要的能量，所以当ΔHr 的值越大，说明淀粉的回生程度越大[20]。

由表2可以看出，随着EBSC添加量的增大，回生焓值和DR值均逐渐下降，说明淀粉晶体堆积的能力逐渐减弱，淀粉回生程度逐渐降低。Xiao等[4]研究发现，茶多酚可降低大米淀粉老化焓值，植物多酚中的羟基易与淀粉中的羟基形成氢键，这个过程可以抑制淀粉多聚物链的形成，从而使得回生淀粉的重结晶在熔融时所需的能量下降。

2.7 EBSC对大米淀粉体外消化的影响

淀粉的来源、淀粉颗粒的大小、淀粉中支链与直链淀粉含量之间的比值、淀粉结晶结构以及分解淀粉的酶的活性等[21]都会对淀粉的消化性能产生影响。

由表3可知，随着EBSC添加量的增加，大米淀粉的RDS含量逐渐下降，SDS、RS含量逐渐上升；而随着回生天数的增加，所有大米淀粉样品的RDS含量也呈现下降趋势，说明随着回生时间的延长，淀粉的消化性逐渐变差。当EBSC添加量为10%时，与对照组相比，在4 ℃回生5 d 的大米淀粉中的RDS下降了57.01%，SDS和RS分别增加了约2倍和19倍。由此可知，在淀粉中添加一定比例的EBSC可以显著抑制淀粉的消化性能，可能的原因是淀粉分子外部结构被EBSC中的羟基分子包围，淀粉酶的水解位点被掩盖在羟基结构之下，从而导致淀粉酶对淀粉分子无法进行特异性识别所致[22]。与此结果相似的是，茶多酚也可导致玉米淀粉和马铃薯淀粉中的SDS和RS的含量增加[5]。Mojica等[23]研究发现，植物多酚类成分对淀粉体外消化性能具有显著的抑制效果，其作用主要表现在对关键消化酶(α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)活性的抑制效果，也表现为植物多酚对淀粉本身结构的影响[24]。因此，植物多酚类提取物或纯多酚与淀粉的共存体系可为开发预防和治疗Ⅱ型糖尿病的替代品提供参考[25]。

表2 黑豆皮乙醇提取物添加量对大米淀粉回生热力学特性及DR值的影响

表3 EBSC添加量对回生大米淀粉体外消化的影响

3 结论

将富含花青素类物质(EBSC)添加到大米淀粉中，其老化度、凝胶强度、回生焓值均显著降低，说明EBSC对大米淀粉的回生有抑制作用。EBSC的添加显著提高了大米淀粉的透光率，且添加2.5%的EBSC对大米淀粉的透光率影响较大。此外，EBSC的添加使得大米淀粉的溶解度、膨胀度增大；随着EBSC添加量的增加，促使大米淀粉的消化体外消化性能下降，RDS含量下降，SDS含量增加。