慢性牙周炎患者Th17/Treg细胞平衡与伴放线聚集杆菌定植的相关性研究

于淑琪，徐 娟，张 淼，董贝贝，陈晓涛

（1新疆医科大学口腔医学院，乌鲁木齐830011；2新疆维吾尔自治区人民医院口腔科，乌鲁木齐830000）

慢性牙周炎是发生在牙周支持组织的慢性感染性疾病，是口腔致病微生物、宿主免疫系统和环境因素组成的生态系统，共同作用的结果[1]。研究表明伴放线聚集杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans，Aa)，牙龈卟啉单胞菌、福塞类杆菌是慢性牙周炎的优势致病菌，其中Aa释放细胞毒性膨胀毒素、白细胞毒素和脂多糖在诱导骨吸收和调节宿主免疫应答方面机制被广泛研究[2-3]。Aa能诱导细胞因子，促使辅助性T细胞Th1、Th2、Treg和Th17细胞分化[4]。免疫应答中Th17细胞和Treg细胞起互为拮抗作用，健康组织中存在Th17/Treg细胞的平衡，而Th17/Treg细胞的失衡会导致破坏性的免疫反应[5]。本研究采用流式细胞术和荧光定量PCR方法，测定Aa含量，分析研究Th17/Treg细胞平衡与伴放线聚集杆菌定植的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料以2019年2月-9月在新疆维吾尔自治区人民医院口腔科就诊的45例慢性牙周炎患者为研究对象，根据患者慢性牙周炎严重程度分为轻度组27例，男性16例，女性11例，平均年龄（53.67±10.59）岁；中重度组18例，男性12例，女性6例，平均年龄（51.50±10.50）岁；对照组27例，男性17例，女性10例，平均年龄（48.04±12.48）岁。本研究经我院伦理委员会批准，且受试者知情同意。

1.2 纳入标准根据Armitage2019年新分类诊断标准[6]：（1）符合慢性牙周炎诊断标准且全身状况良好；（2）全口至少10颗天然牙；（3）6个月内未接受过牙周治疗或服用过免疫调节剂、抗菌药物；（4）患者依从性强，自愿参加。

1.3 排除标准（1）精神疾病、意识障碍；（2）吸烟史；（3）免疫相关性疾病；（4）妊娠及哺乳期女性；（5）糖尿病史、高血压病史和2个月内急性感染病史。

1.4 分组标准牙周炎疾病严重程度评定标准[7]分为轻度、中度、重度3类，轻度：牙龈有炎症和探诊出血，牙周袋≤4 mm，临床附着丧失1～2 mm，X线片显示牙槽骨吸收不超过根长的1/3，可有或无口臭。中重度组：中度：牙龈有炎症和探诊出血，也可有脓，牙周袋≤6 mm，附着丧失3～4 mm，X线片显示牙槽骨吸收或角型吸收超过根长的1/3，但不超过根长的1/2，牙可能有轻度松动，多根牙的根分叉区可能有轻度病变。重度：牙龈炎症较明显或可发生牙周脓肿，牙周袋＞6 mm，附着丧失＞5 mm，X线片显示牙槽骨吸收超过根长的1/2。对照组纳入标准：探诊无出血，全口牙的探诊深度≤3 mm，无附着丧失，无牙槽骨吸收，无牙龈退缩。

1.5 仪器与试药抗人CD3、CD4、IL-17A、CD25、CD127单克隆抗体(美国Biolegend公司)，佛波酯(PMA)、离子霉素(IO)、蛋白转运抑制剂(BFA)(购美国Biogems公司)，淋巴细胞分离液(天津华科生物有限公司)，FACS Canto TMII流式细胞仪（美国BD公司）。细菌基因组DNA提取试剂盒(南京诺维赞公司)，QuantiNova SYBR Green染料法试剂盒、QIAquick PCR产物纯化试剂盒(德国GmbH公司)，质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司），PCR仪（德国TPROFESSION公司），微量分光光度计（上海赛默飞有限公司），罗氏LihgtCycler480II荧光定量PCR仪（上海罗氏诊断产品有限公司），标准菌株伴放线聚集杆菌(北纳创联生物科技有限公司，BNCC336945)。

1.6 方法

1.6.1 龈下菌斑样本的采集及临床指标的检测 选取牙周健康者上颌第一磨牙颊侧近中位点(健康位点)和慢性牙周炎患者口内牙周袋最深位点取样。用无菌刮匙去除龈上菌斑，无菌棉球隔湿，干燥，牙周袋插入灭菌纸尖，遇到阻力为止，静置30 s，置于EP管中-20℃冻存备用。

1.6.2 实时定量PCR反应条件 所有样本的反应体系均20 uL:2×QuantiNova SYBR Green Master Mix 10µL；上、下游引物各1.4µL；DNA模板均为1µL，ddH20补足体系。反应参数:预变性95℃2 min;变性95℃5 s;退火/延伸60℃10 s;进行50个循环。每次反应均设空白对照和标准阳性对照。

1.6.3 外周血中Th17、Treg水平的检测 分离PBMC：清晨空腹采集受检者外周静脉血4 mL，肝素抗凝，离心取血浆，-80℃保存待测。经Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。Th17检测：将PBMC转移至24孔板中，加入佛波酯(PMA)和离子霉素(IO)1 h后，放入蛋白转运抑制剂（BFA），于37℃培养箱中培养4 h，刺激细胞活化，并设置同型对照组，标记CD3、CD4抗体，破膜孵育后标记IL-17A抗体，测定Th17细胞百分比。Treg检测：在PBMC中分别标记CD4、CD25、CD127抗体，避光孵育20 min后，PBS清洗，离心弃上清，重悬细胞，通过流式细胞仪测定Th17、Treg细胞水平。

1.7 统计学处理采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析，计数资料以均数±标准差（-x±s）表示，采用t检验，相关性分析采用采用Spearman相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组龈下菌斑中Aa菌量（对数转换后）比较轻度组Aa菌量为4.37±0.84，中重度组Aa菌量为4.13±0.82，对照组Aa菌量为4.40±0.89，3组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 Aa菌量（对数转换后）与Treg细胞含量、Th17细胞含量、Th17/Treg比值和PD的相关性Aa菌量与Treg细胞（%）呈正相关（r=0.290，P＜0.05，见图1）；Aa菌量与Th17细胞（%）无相关性（r=-0.171，P＞0.05，见图2）；Aa菌量与Th17/Treg比值呈负相关（r=-0.278，P＜0.05，见图3）；PD与Aa菌量无相关性（r=-0.115、P＞0.05，见图4）。

图1 Aa菌量（对数转后）与Treg细胞含量的相关性

图2 Aa菌量（对数转后）与Th17细胞含量的相关性

图3 Aa菌量（对数转换后）与Th17/Treg比值的相关性

图4 Aa菌量（对数转换后）与PD的相关性

3 讨论

牙菌斑是慢性牙周炎致病的始动因子，牙周炎的发生不仅是某些种属细菌的存在引发的，且与牙周袋中菌群失调所致的牙周微环境失调密切相关。Aa是引起牙周炎、种植体周炎等口腔感染的重要病原菌。不同血清型的伴放线放线菌有不同的毒力因子表达，伴放线聚集杆菌定殖后，可利用细胞毒性膨胀毒素(CDT)、白细胞毒素和脂多糖(LPS)逃避宿主的天然防御机制，并激活病理生理学炎症反应[8]。Torrungruang等[9]发现少量牙龈卟啉单胞菌、一定数量的Aa、齿垢密螺旋体和中间普氏菌的定植就能导致重度牙周炎发生。本研究应用已知浓度的Aa重组质粒，确定龈下菌斑中的初始Aa的数量与实时荧光定量PCR的CT值的标准曲线，定量分析每例标本中Aa菌量，探索慢性牙周炎及牙周健康者龈下菌斑Aa的分布规律。结果发现，Aa菌量在慢性牙周炎各组及对照组中数量均无显著差异，且相关性分析Aa定植菌量与PD无显著相关性。Tan等[10]对中国牙周病患者和牙周健康者龈下菌斑Aa的PCR检测也证实，两组的检出率基本无差异，提出Aa可能是中国人群的正常菌群之一。放线聚集杆菌在儿童及成人均有较高的检出率[11-12]。Yuan等[13]研究发现Aa的数量随着儿童年龄的增长有减少趋势。Tomita等[14]指出牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌菌量与PD明显相关，Aa菌量与PD关系不大。国内外相关研究[15-17]实验结果提示：Aa检出率及数量水平与牙周疾病无显著相关，Aa是牙周的正常菌群。

新发现的CD4+T细胞亚群Th17细胞分泌致炎因子IL-17，表达特异性转录子维甲酸相关孤核受体，在多种系统疾病的发生发展中发挥重要作用。Treg细胞表达转录因子Foxp3，抑制抗原特异性CD4+T细胞活化、增殖、分化，是参与免疫调节和维持机体自身免疫耐受的重要组成部分，两者在发育和功能上相互联系与拮抗，其平衡变化促进或抑制炎症，与牙周炎的病程及牙槽骨吸收有关[18]。本研究对Aa细菌量与Th17细胞，Treg细胞及Th17/Treg比值进行相关性分析发现，Aa菌量与Th17细胞（%）无明显相关性。有报道Aa的b型以及c型具有更高的毒力特性的，与不同人群的侵袭性牙周炎牙周破坏有关；a型、c型与无牙周炎症状的受试者有关[19]。一项为期8年有107位研究对象的血清型动力学研究显示[20]，Aa血清型的优势发生了显著变化，b型检出率从53.7%下降到30.2%，c型检出率从14.6%上升到35.8%，e型检出率从2.4%上升到9.4%，这种变化并未对临床参数产生影响。目前发现这种类型的转变与Yang等[21]所观察到的在年轻受试者中占主导地位结论相同。

所有的Aa血清型均导致人T淋巴细胞活化，由Aa血清b型菌株或其纯化的脂多糖引发的树突状细胞刺激T淋巴细胞，能检测到更高水平的Th1和Th17相关转录因子和细胞因子，发生相关免疫应答及骨吸收[22]。表明炎症微环境改变后，Aa毒力因子发挥作用，免疫反应被激活，随着时间的推移，通过促进Treg抑制性免疫细胞数量增加，消减宿主的免疫防御能力，促进慢性牙周炎症进展。