浙派裘氏妇科治疗子宫内膜异位症的共性规律及常用药对分子机制的研究

李慧 朱群飞 杨华娣 王斌 章雯超 邵一峰

1.浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006 2.浦江县中医院 3.浙江中医药大学

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）主要表现为痛经、慢性盆腔痛、性交痛及不孕等，临床发病率约10.00%～15.00%，其中合并不孕症的比例高达40.00%，对女性的身体健康和家庭和谐造成严重的影响[1]。腹腔镜手术是治疗EMs的首选疗法，虽能取得一定的临床疗效，但无法完全清除深层病灶组织，术后复发率高[2]。促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin-releasing hormone agonists，GnRH-a） 对EMs合并不孕症有一定的治疗作用，但其具有血管运动综合征、骨质疏松等副作用，导致的骨质丢失需要1年甚至更长时间才能恢复[3]。近年来中医药学者在中医药治疗EMs方面进行了大量的临床和实验研究，证明中医药治疗EMs疗效显著，不仅能明显控制盆腔疼痛，而且能有效治疗不孕，预防术后复发等[4-5]。

裘氏妇科由首批国家级名老中医、全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师、国家突出贡献专家裘笑梅先生创立而成，是浙派中医的重要学科流派之一。裘氏妇科的经验是裘老一生临床实践与中医理论结合、突破、创新的结果，是发展中医药学的宝贵财富。本文通过临床侍诊省内有一定影响力的4位裘氏妇科传人，采用现代化信息技术，开展裘氏妇科名中医群治疗EMs的中医思辨特征和共性规律研究，总结其在EMs诊疗中的群体共性规律，并对常用药对进行分子机制研究，以期更好地传承裘氏妇科学术思想并服务临床。

1 资料和方法

1.1 病例来源 2019年1月1日至2019年10月30日临床随诊裘老的4位嫡传弟子（张萍青、吴燕平、王幸儿、张婷），收集、统计随诊期间所有符合标准的病例。

1.1.1 诊断标准 参照西医《妇产科学》[3]和《子宫内膜异位症诊断与治疗规范》[6]拟定：（1）症状：疼痛（随月经周期规律性发作的下腹痛，或持续盆腔疼痛，或性交痛等），不孕。（2）妇科检查：子宫直肠陷凹处、子宫颈上方、宫骶韧带处扪及痛性结节，或扪及卵巢囊实性包块，伴或不伴压痛。（3）辅助检查：盆腔B超提示囊性包块，单房或分隔多房，囊壁厚，囊内有细小弱光点；血清糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）水平轻、中度升高。 符合上述标准（1）及（2）（3）两项中任意一项者，即诊断为EMs。

1.1.2 纳入标准 （1）符合EMs诊断；（2）未行手术治疗；（3）有生育要求；（4）年龄25～35岁；（5）能够耐受中药口服治疗；（6）不伴有严重的心、肝、肾、造血系统疾患或恶性肿瘤、精神病患者；（7）未经历长时间的其他治疗方案。

1.1.3 排除标准 （1）卵巢子宫内膜异位囊肿直径＞5cm或短期内明显增大者；或影像学检查提示实性或乳头状结构，彩色多普勒超声提示病灶血流丰富，阻力指数（resistance index，RI）低等病变良恶性不明确者。（2）妊娠或哺乳期女性。（3）正在参加其他临床研究者。

1.2 处方筛选 按上述标准纳入病例处方后，若符合以下情况，则剔除病例。剔除标准：（1）治疗过程中出现其他严重疾病；（2）中药服用过程中出现严重的药物相关并发症；（3）登记病例信息不完整；（4）多种治疗同时进行；（5）中药口服疗效不明确；（6）服药过程中成功妊娠。共筛选出处方716份，其中张萍青104份、吴燕平339份、王幸儿126份、张婷147份。

1.3 数据收集及规范化处理 采用Excel表录入患者资料，包括姓名、就诊时间、证型、治法、方药、用药剂量等，将处方中出现的药物按《中华人民共和国药典》（2015年版）及全国中医药院校规划教材《中药学》（第9版）进行药物名称规范化及功效分类，其中同一种药材的产地及炮制方法不同，但功能相同者，为避免频次降低，影响关联性，将其合并为一味药，如炒白芍、生白芍统一为白芍等。

1.4 数据库建立 建立基础数据库，包括处方编号、就诊时间、姓名、年龄、证型、处方药物6个列变量。建立1个聚类分析数据库，将高频中药定义为列变量，用各自代码表示，以收集到的处方作为样本，若该处方出现该“中药”则录入“1”，若无则录入“0”。 将处方中出现的所有中药建立3个子数据库：药性数据库、药味数据库、药物功效分类数据库。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，对药物频数、药物性味、药物功效分类、证型进行描述性分析，对高频药物进行系统聚类分析，并采用clementine12.0的Apriori算法对药物之间的关系进行关联分析并总结其共性规律。

1.6 网络药理学分析数据库与软件 中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php），检索时间2019年12月15日；GeneCards数据库（https://www.genecards.org/），检索时间2019年12月15日；蛋白质数据库 （Universal Protein，UniProt）（http://www.uniprot.org/uploadlists/），检索时间2019年12月15日；网络拓扑属性分析软件 Cytoscape 3.6.0、生物学信息注释数据库 （the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/），检索时间2019年12月15日；蛋白质互作（proteinprotein interaction，PPI）网络数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl），检索时间2019年12月15日。

1.7 常用药对化学成分的收集与筛选及EMs相关靶点基因的获取 在TCMSP数据中分别以 “赤芍”“丹参”作为关键词进行检索，获取两种药物的化学成分，以化合物口服利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和类药性（drug-like，DL）＞0.18为标准[7]，筛选出活性成分及其作用靶标。利用UniProt数据库，限定物种为“Homo sapiens（人类）”检索对应的靶标基因。利用GeneCards数据库，以“Endometriosis”为关键词检索EMs相关的靶标基因。

1.8 活性成分-EMs共同靶标的获取及网络构建 将赤芍-丹参药对的活性成分对应的靶标基因与EMs相关靶标基因进行比对，筛选出共同靶标基因。利用Cytoscape软件构建其靶标网络。

1.9 基因本体（gene ontology，GO）生物过程与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析 将赤芍-丹参药对的作用靶标导入DAVID中，进行GO生物过程分析与KEGG通路富集分析，得到通路富集结果。选取P＜0.001的生物过程和通路，并且按照基因富集数从大到小筛选出排列前20位的生物过程和通路。

2 结果

2.1 证型频数分析 分别对4位医家处方中的证型进行合并、归纳并进行频数统计。其中张萍青证型频数最高的为瘀热互结证，共出现49次，出现频率为47.12%（该证型频数/证型总频数）；吴燕平证型频数最高的为肾虚血瘀证，共出现112次，出现频率为33.04%；王幸儿证型频数最高的为瘀热互结证，共出现38次，出现频率为30.16%；张婷证型频数最高的为瘀热互结证，共出现57次，出现频率为38.78%。4位医家处方中最常见的证型均为瘀热互结症、肾虚血瘀证、气滞血瘀证。见表1～4。

表1 张萍青证候频数统计表

表2 吴燕平证候频数统计表

表3 王幸儿证候频数统计表

表4 张婷证候频数统计表

2.2 用药分析 根据证型频数分析结果，对3种最常见的证型即瘀热互结症、肾虚血瘀证、气滞血瘀证的用药分别进行频数分析、性味分析、功效分析，对EMs的所有用药进行关联规则分析。

2.2.1 瘀热互结证用药分析

2.2.1.1 瘀热互结证用药频数分析 张萍青共用药54种，累计用药频数773次，其中频数最多的单味药是赤芍，共39次，该药频率1为5.81%（单味药用药频数/总体用药频数）、频率2为79.59%（单味药用药频数/医案数）；吴燕平共用药59种，累计用药频数1 027次，其中频数最多的单味药是赤芍，共79次，该药频率1为7.69%、频率2为73.83%；王幸儿共用药49种，累计用药频数621次，其中频数最多的单味药是赤芍，共37次，该药频率1为5.96%、频率2为97.37%；张婷共用药60种，累计用药频数799次，其中频数最多的单味药亦是赤芍，共48次，该药频率1为6.01%、频率2为84.21%。4位医家频数最多的单味药均为赤芍。在频数排名前10的药物中，赤芍、丹参、忍冬藤、丹皮均为4位医家常用高频药物。见表5～8。

表5 张萍青在瘀热互结证中的用药频数分析

表6 吴燕平在瘀热互结证中的用药频数分析

表7 王幸儿在瘀热互结证中的用药频数分析

表8 张婷在瘀热互结证中的用药频数分析

2.2.1.2 瘀热互结证用药性味分析 参照 《中药学》中的四气五味，对各名中医的处方用药进行性味频数分析，分为凉、微寒、寒、大寒、微温、温、热、大热、平9种药性及甘、微甘、苦、微苦、辛、微辛、酸、微酸、咸、淡、涩11种药味，因“淡附于甘”，涩与酸作用相似，故将药味总结为酸、苦、甘、辛、咸5种。对各名中医的处方用药进行药性频数及药味频数统计分析，4位医家用药均以苦寒类为主。

2.2.1.3 瘀热互结证用药功效分析 根据 《中药学》中药物所属功效以及4位医家实际用药情况，将本研究中所有药物分为8类，分别为解表药、清热药、利水渗湿药、理气药、活血化瘀药、止咳化痰平喘药、补虚药及其他类药。对4位医家的处方用药进行药效频数统计分析，在本证型中，4位医家使用最多的药物均为清热药及活血化瘀药，张萍青用药频率为32.18%及29.25%，吴燕平用药频率为34.21%及25.34%，王幸儿用药频率为30.19%及20.55%，张婷用药频率为36.35%及23.26%。此外，张萍青、王幸儿善用补虚药，用药频率分别为15.59%、13.40%，使用最多的药物分别为醋鳖甲、当归、鹿角及白术、当归、醋鳖甲；吴燕平、张婷善用理气药，用药频率分别为14.45%、12.65%，使用最多的药物分别为佛手、醋香附、川楝子及橘络、川楝子、佛手。

2.2.1.4 瘀热互结证高频药物聚类分析 将4位医家使用的前10位高频药物进行聚类分析，根据聚类分析结果，并结合专业知识，将功效相同或相近的药物聚为同一类。

张萍青的10味高频药物可分为3类：第1类包括赤芍、大血藤、丹皮、蒲公英、忍冬藤、皂角刺；第2类包括丹参、鸡血藤；第3类为当归、醋鳖甲。吴燕平的10味高频药物可分为3类：第1类包括赤芍、蛇舌草、忍冬藤、大血藤、丹皮；第2类包括丹参、泽兰、猫爪草；第3类为佛手、醋香附。王幸儿的10味高频药物可分为3类：第1类包括赤芍、丹皮、大血藤、皂角刺、忍冬藤；第2类包括丹参、猫爪草；第3类为白术、当归、醋鳖甲。张婷的10味高频药物可分为3类:第1类包括赤芍、丹皮、大血藤、忍冬藤；第2类包括刺蒺藜、丹参、猫爪草；第3类为橘络、川楝子、佛手。

2.2.2 肾虚血瘀证用药分析

2.2.2.1 肾虚血瘀证用药频数分析 张萍青共用药65种，累计用药频数784次，其中频数最多的单味药是丹参，共18次，该药频率1为2.30%、频率2为90.00%；吴燕平共用药58种，累计用药频数1 112次，频数最多的单味药是当归，共89次，该药频率1为8.00%、频率2为79.46%；王幸儿共用药49种，累计用药频数741次，频数最多的单味药是当归，共24次，该药频率1为3.24%、频率2为88.89%；张婷共用药54种，累计用药频数390次，频数最多的单味药是丹参，共25次，该药频率1为6.41%、频率2为89.28%。4位医家频数最多的单味药为丹参、当归，而频数排名前10的药物中，赤芍、丹参、当归均为4位医家常用高频药物。见表9～12。

表9 张萍青在肾虚血瘀证中的用药频数分析

表10 吴燕平在肾虚血瘀证中的用药频数分析

表11 王幸儿在肾虚血瘀证中的用药频数分析

表12 张婷在肾虚血瘀证中的用药频数分析

2.2.2.2 肾虚血瘀证用药性味分析 在本证型中，张萍青、吴燕平用药以甘温类为主，王幸儿、张婷用药以苦寒类为主。

2.2.2.3 肾虚血瘀证用药功效分析 本证型中，4位医家使用最多的药物均为补虚药及活血化瘀药，张萍青用药频率为36.27%及30.15%，吴燕平用药频率为30.29%及35.62%，王幸儿用药频率为36.57%及33.55%，张婷用药频率为31.46%及39.96%。此外，张萍青、王幸儿善用清热药，用药频率分别为13.29%、11.36%，使用最多的药物分别为赤芍、龙葵及知母、赤芍、龙葵；吴燕平善用理气药，用药频率为15.29%，使用最多的药物为醋香附、佛手；张婷善用清热药及理气药，用药频率分别为13.22%、15.67%，使用最多的药物分别为赤芍、丹皮、龙葵及川楝子、佛手。

2.2.2.4 肾虚血瘀证高频药物聚类分析 本证型中，张萍青的10味高频药物可分为2类：第1类包括枸杞子、肉苁蓉、仙灵脾、炙黄芪、当归；第2类包括丹参、鸡血藤、猫爪草、赤芍。吴燕平的10味高频药物可分为3类：第1类包括当归、熟地黄、桑寄生、山药、枸杞子、菟丝子；第2类包括丹参、赤芍；第3类为醋香附、佛手。王幸儿的10味高频药物可分为3类：第1类包括当归、山药、白术、丹参、赤芍、山棱；第2类包括龙葵、知母；第3类为醋香附、佛手。张婷的10味高频药物可分为3类:第1类包括丹参、刺蒺藜、赤芍、丹皮、龙葵、猫爪草；第2类包括熟地黄、当归；第3类为川楝子、佛手。

2.2.3 气滞血瘀证用药分析

2.2.3.1 气滞血瘀证用药频数分析 张萍青共用药45种，累计用药频数315次，其中频数最多的单味药是丹参，共12次，该药频率1为3.81%、频率2为92.31%；吴燕平共用药58种，累计用药频数1 794次，频数最多的单味药是白芍，共58次，该药频率1为3.23%、频率2为90.63%；王幸儿共用药49种，累计用药频数440次，频数最多的单味药是当归，共20次，该药频率1为4.55%、频率2为100.0%；张婷共用药44种，累计用药频数752次，频数最多的单味药是丹参，共32次，该药频率1为4.26%、频率2为91.43%。4位医家频数最多的单味药为丹参、白芍、当归。在频数排名前10的药物中，赤芍、丹参、当归、绿梅花均为4位医家常用高频药物。 见表13～16。

表13 张萍青在气滞血瘀证中的用药频数分析

表14 吴燕平在气滞血瘀证中的用药频数分析

表15 王幸儿在气滞血瘀证中的用药频数分析

表16 张婷在气滞血瘀证中的用药频数分析

2.2.3.2 气滞血瘀证用药性味分析 在本证型中，4位医家用药均以苦寒类药物为主。

2.2.3.3 气滞血瘀证用药功效分析 本证型中，4位医家使用最多的药物均为理气药及活血化瘀药，张萍青用药频率为49.39%及33.46%，吴燕平用药频率为48.51%及37.92%，王幸儿用药频率为52.57%及33.15%，张婷用药频率为49.56%及49.99%。此外，张萍青、吴燕平善用补虚药，两者同时使用当归、白芍。4位医家同时善用清热药，同时使用赤芍，并且张萍青、王幸儿、张婷同时使用龙葵。

2.2.3.4 气滞血瘀证高频药物聚类分析 本证型中，张萍青的10味高频药物可分为2类：第1类包括炒枳壳、川楝子、绿梅花、柴胡、党参；第2类为丹参、当归、赤芍、白芍、龙葵。吴燕平的10味高频药物可分为2类：第1类包括白芍、丹参、赤芍、刺蒺藜、当归、猫爪草；第2类包括绿梅花、醋香附、佛手、川楝子。王幸儿的10味高频药物可分为2类：第1类包括当归、赤芍、丹参、白芍、山棱、猫爪草、龙葵；第2类为川楝子、刺蒺藜、绿梅花。张婷的10味高频药物可分为2类：第1类包括丹参、丹皮、赤芍、猫爪草、龙葵、刺蒺藜、当归；第2类为川楝子、佛手、绿梅花。

2.3 药物关联规则分析 分别将4位医家治疗EMs的所有处方中使用频数前20位的药物作为研究对象，设置支持度≥50%，置信度≥80%，最大前项数设置为3，得到两味药的药对关联规则，筛选出4位医家常用共同药对丹参-赤芍。见表17～20。

表17 张萍青药物关联规则

表18 吴燕平药物关联规则

表19 王幸儿药物关联规则

表20 张婷药物关联规则

2.4 常用药对丹参-赤芍的分子机制分析

2.4.1 丹参-赤芍药对活性成分、靶标基因及EMs靶标基因 根据OB＞30%和DL＞0.18，筛选出具有作用靶标的丹参、赤芍的活性成分共67个及其靶标共143个，因文本较长，下文均以代号表示活性成分。根据UniProt数据库将靶标转换为靶标基因，从GeneCards数据库获得了1 388个EMs的相关靶标基因。见表21。

表21-1 作用靶标相关的丹参-赤芍活性成分表

表21-2 作用靶标相关的丹参-赤芍活性成分表

2.4.2 丹参-赤芍药对治疗EMs的作用靶标预测 将丹参-赤芍药对的靶标基因与EMs的相关靶标基因进行比对后，筛选出可能是丹参-赤芍药对治疗的作用靶标78个。见表22。

表22 丹参-赤芍药对治疗EMs的作用靶标

2.4.3 丹参-赤芍药对活性成分与EMs靶标网络构建 在Cytosacpe软件中导入丹参-赤芍药对的活性成分与EMs作用靶标，构建活性成分-靶标网络。见图1。

图1 丹参-赤芍药对活性成分-EMs作用靶标网络图

2.4.4 靶蛋白相互作用网络分析 将丹参-赤芍药对可能治疗EMs的78个作用靶标导入PPI数据库，设置置信度得分（confidence score）为0.900，获取相互作用关系。见图2。统计其连接数，连接数最多的5个靶点为：信号转导和转录活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，PKB1）、 转录因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1/JUN）、 丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、核转录因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65/RELA）。

图2 丹参-赤芍药对靶蛋白相互作用网络图

2.4.5 GO和KEGG通路富集分析 对丹参-赤芍药对活性成分的对应靶标进行GO分析和KEGG分析，以P＜0.001为标准，筛选出排名前20的GO过程和KEGG代谢通路。见表23、24。

表23 丹参-赤芍药对活性成分对应靶标GO分析

表24 丹参-赤芍药对活性成分对应靶标KEGG分析

3 讨论

3.1 扶正为本，化瘀为先 EMs在中医古籍中无病名记载，据其临床特点可归属于“痛经”“癥瘕”“不孕”等范畴。裘老认为EMs的基础病因为“瘀”“热”，基本病机是瘀热互结；然而病久及肾，损伤正气真阳，阳气不能外达，温煦鼓动无力，则瘀滞更重，故肾虚亦是根本，补肾化瘀清热为其有效的解决方案。现代临床研究显示，清热化瘀药能够明显降低EMs的严重程度，并且对患者激素水平具有一定的抑制作用[8]。结合本研究中的病案提示，瘀热互结证、肾虚血瘀证、气滞血瘀证是EMs临床常见证型。4位医家传承裘氏妇科学术思想，皆认为EMs由“离经之血”阻滞胞脉，久而化热，瘀热互结而成，且病久及肾，因此在处方用药中多应用补肾清热化瘀之法，攻补兼施。

3.2 辨证论治，同中存异 针对瘀热互结证，4位医家均采用苦寒类的清热药及活血化瘀药为主，与裘老清化瘀热的学术思想相符合。此外，张萍青、王幸儿善用醋鳖甲、当归、鹿角、白术等补虚药。醋鳖甲软坚散结、祛瘀止痛；当归养血活血、化瘀止痛；鹿角温肾行血、消肿止痛；白术健脾益脾、益气止痛，补虚治其本，化瘀治其标，从而标本同治。吴燕平、张婷善用佛手、醋香附、川楝子、橘络等理气药。妇人病久多气机郁滞，气不行血，瘀滞更重，故疏肝行气以化其瘀。

针对肾虚血瘀证，4位医家使用最多的药物均为补虚药及活血化瘀药。张萍青、吴燕平用药以甘温类为主，王幸儿、张婷用药以苦寒类为主，甘温补益温阳，苦寒清热化瘀。此外，在补肾活血的同时，张萍青、王幸儿、张婷多使用知母、赤芍、龙葵、丹皮等清热药。瘀久化热，热能伤阴，知母可清热滋阴润燥；瘀热互结，气血不通则痛，赤芍、龙葵、丹皮可清热凉血、散瘀止痛。吴燕平则多使用醋香附、佛手等理气药，以疏肝解郁、行气化瘀。

针对气滞血瘀证，4位医家多以苦寒类药物为主，使用最多的药物均为理气药及活血化瘀药。在行气活血化瘀的同时，4位医家均使用清热药，如赤芍、龙葵。张萍青、吴燕平亦使用补虚药，如当归、白芍，以补血柔肝止痛。

3.3 善用药对，清化逐瘀 结合4位医家临证经验、处方聚类分析和药物关联规则分析提示，4位医家治疗各型EMs均善用丹参-赤芍药对。丹参活血凉血、祛瘀通经，赤芍清热凉血、散瘀止痛，两者共奏清化逐瘀之效，符合裘老治疗EMs的基本学术思想。

3.4 丹参-赤芍药对治疗EMs具有多靶点的作用机制 网络药理学研究发现丹参-赤芍药对具有67种活性成分，治疗EMs的靶标共78个，其中STAT3、PKB1、JUN、MAPK1、RELA等为关键靶标，说明该药对可能通过调控PI3K-PKB信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路等生物学信号通路治疗EMs。研究已证实，PI3K-PKB信号通路的异常是EMs发病机制之一，并且影响疾病进展[9]；IL-17信号通路可通过触发促炎性细胞因子和血管生成生长因子促进EMs的发生[10]；HIF-1信号通路则通过上调异位子宫内膜细胞的自噬作用、促进子宫内膜间质细胞的迁移和侵袭，从而导致疾病发生发展[11]。提示该药对治疗EMs作用机制复杂多样，非通过单一蛋白靶标发挥作用，其具体作用机制仍需进一步实验验证。

综上所述，4位裘氏妇科传承人治疗EMs，均以“肾虚”为本，“瘀”“热”互结为标，以苦寒、甘温之品补肾虚、化瘀血、清瘀热、行气滞。治疗上辨证论治，攻补兼施，扶正为本，清热化瘀，且善用药对，寓清化于温补，化瘀清热又补肾益气，以达标本同治之功，符合EMs临床虚实夹杂复杂证候的治疗方法。吴燕平与王幸儿治疗EMs用药之意相似，清热化瘀之中兼顾补益脾肾，攻补兼施。张萍青、王幸儿用药之意相似，清中有补，清热化瘀之中兼顾补益脾肾。吴燕平、张婷善用理气药，疏肝理气行滞而散其瘀。本研究提炼出裘氏妇科治疗EMs的常用药对“丹参-赤芍”，并从网络药理学的角度揭示了该药对治疗EMs的分子机制，为中医药治疗EMs提供了现代理论依据，为今后裘氏妇科团队研究裘氏妇科经验提供了前期基础。然而本研究是对流派传承人经验方的总结分析，经验方的作用机制尚缺乏实验验证，可以作为进一步研究的方向。