固冲汤对IgA肾病模型大鼠肾组织TGF-β1含量及病理形态的影响

唐 峰，余舒文，方 靖，余杨桦

0 引言

IgA肾病是全球最常见的原发性肾小球疾病，占原发性肾小球疾病的25%～50%[1]，病理表现为肾小球系膜细胞增生及基质增多，以IgA为主的免疫复合物沉积，临床以血尿和蛋白尿为主要表现。IgA肾病中医常从“尿血”“水肿”“肾风”等论治，究其病因病机常责之为肾虚。从中医角度来看，IgA肾病患者常素体亏虚，加之风湿之邪内扰于肾，肾虚不固，封藏失司，精微之物由小便流失，而固冲汤补肾固冲止血的作用恰好与之相应。目前有研究发现，TGF-β受体的激活在肾组织纤维化中起着重要作用[2-3]。TGF-β1通过诱导肾小球系膜细胞及足细胞凋亡，加速细胞外基质的生成及沉积，加重肾小管间质病变，刺激肾小球硬化，进而使疾病恶化[4-5]。本研究基于上述理论基础及临床研究，观察固冲汤对IgA肾病模型大鼠肾组织病理变化的影响，并通过观察肾组织TGF-β1含量的变化，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SD大鼠40只，雌性，体重(140±10) g，12周龄，由浙江中医药大学实验动物中心提供，并由浙江中医药大学实验动物中心饲养及管理，饲养于清洁级大鼠实验室中。实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005，实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2018-0012。经普通饲料适应性喂养1周后，采用随机数字表法，将动物分为正常组、模型组、固冲汤组、福辛普利对照组，每组10只。

1.2 主要试剂药物及仪器 福辛普利(蒙诺)购自余杭区第一人民医院；固冲汤水煎浓缩液(山萸肉、煅龙骨、煅牡蛎、炒白术、生黄芪、炒白芍、棕榈炭、五倍子、海螵蛸、茜草)，药材购自浙江省中医院；牛血清白蛋白(BSA)购自深圳晶美生物有限公司；葡萄球菌肠毒素B(SEB)购自中国军事医学科学院微生物流行病研究所；兔抗大鼠IgA抗体购自上海信然生物技术有限公司；TGF-β1检测试剂盒购自美国Promega公司。自动生化分析仪、高速离心机、光学显微镜、日本Olympus荧光显微镜，由余杭区第一人民医院提供。

1.3 造模 参照文献[6-8]的造模方法，正常组隔日予生理盐水4 ml/kg灌胃，模型组、固冲汤组、福辛普利组自实验的第1天起隔日0.1%BSA酸液400 mg/kg灌胃，第6周尾静脉注射1%BSA缓冲液20 mg/kg，1次/d，连续3次，第8周尾静脉注射葡萄球菌肠毒素(SEB) 0.8 mg/kg，每周1次，连续3周，同时腹腔注射弗氏佐剂。

1.4 干预方法 造模第8周开始给予相应的药物灌胃，连续5周，每次给药剂量按照“由成人量(mg/kg)换算成动物剂量的倍数简表”计算，即固冲汤组灌服固冲汤水煎浓缩液，福辛普利组(蒙诺)灌服福辛普利水溶液(药品，药物溶于生理盐水)，正常组及模型组予等量的生理盐水灌胃。

1.5 观察指标及检测方法 第12周实验结束，颈椎脱臼法处死大鼠，无菌摘取大鼠右侧肾脏，肾组织常规固定、脱水、石蜡包埋、切片，进行HE、PAS、Masson、免疫荧光显色，显微镜下观察并拍照。①HE染色法观察肾组织病理形态学变化及IgA沉积：肾组织经10%中性缓冲福尔马林固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片后，行常规HE染色显微镜下观察。②Masson染色：肾组织经10%中性缓冲福尔马林固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片后，行常规Masson染色显微镜下观察。③PAS染色：肾组织经10%中性缓冲福尔马林固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片后，行常规PAS染色显微镜下观察。④免疫荧光法检测肾组织：直接法染色，取新鲜肾脏组织进行冰冻切片(4 μm)，干燥、冷丙酮固定10 min，PBS液洗后滴加FITC标记的兔抗大鼠IgA抗体，温度37 ℃烘箱中孵育40 min，PBS液洗后用缓冲液甘油封片，荧光显微镜下观察。⑤ELISA法检测肾组织TGF-β1含量：制备肾组织匀浆，按照Promega公司提供的TGF-β1双抗体夹心方法检测。

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏病理染色结果比较 HE染色实验显示，福辛普利组和固冲汤组大鼠肾小球有部分炎症反应，部分系膜增生，少量肾小球周围管腔变窄，组织中有少量出血和空泡现象。模型组大鼠肾小球炎症反应增多，系膜增生，基质增厚，肾小球周围管腔变窄，出血严重，肾小管上皮细胞肿胀严重，部分肾小管壁呈空泡样。正常组肾小球周围空隙较大，肾小球内致密区正常，近曲小管、远曲小管的管腔清晰，上皮细胞正常，血管腔内清晰。Masson实验显示，福辛普利组和固冲汤组有少量肾小球系膜组织增生和少量的基膜增厚；模型组可见中重度系膜组织增生，系膜基质增厚，部分肾小管肿胀。PAS染色中，福辛普利组和固冲汤组肾小球中的糖原比正常组有少量增多。模型组可见肾小球中的糖原有明显增多。见图1～图3。

图1 各组大鼠肾脏HE染色结果比较(HE，200×)

图2 各组大鼠肾脏Masson染色结果比较(200×)

图3 各组大鼠肾脏PAS染色结果比较(200×)

2.2 大鼠肾脏IgA沉积情况 组织免疫荧光检测可见，IgA蛋白主要在血管上皮上表达，在肾小球上有少量表达。见图4。

图4 各组大鼠IgA沉积情况(200×)

2.3 各组大鼠肾组织TGF-β1含量比较 通过双抗体夹心检测方法检测各组大鼠肾组织TGF-β1含量。与正常组比较，福辛普利组、固冲汤组大鼠肾组织TGF-β1表达明显增强(P<0.05)；与模型组比较，正常组TGF-β1表达较弱(P<0.05)；与模型组比较，固冲汤组大鼠肾组织TGF-β1表达明显减弱(P<0.05)。见图5。

图5 各组大鼠肾组织TGF-β1含量比较

3 讨论

传统医学并无IgA肾病的诊断，根据其水肿、泡沫尿、血尿以及终末期的少尿、无尿，大多以“水肿”、“关格”、“尿浊”等论治。其主要病因责之先天不足，或因饮食、内伤、情志、劳倦导致正气不足，复感外邪而发，其病机为本虚标实、虚实夹杂，多兼有湿、热、虚、瘀。病位在肾，与肝、脾、肺等脏腑密切相关。固冲汤源于张锡纯的《医学衷中参西录·治妇科方》，具有固冲摄血、补脾益肾的功效。张锡纯认为，肾虚不固是崩漏发生的关键原因，即固冲汤的主治证，临床可见猝然血崩或月经过多，或漏下不止，兼见头晕，腰膝酸软，神疲乏力，初起舌色如常，随出血量增多，气随血脱，可见气短肢冷，舌淡等脾肾二虚证候，舌色如常，不红、不淡、无瘀点瘀斑。正因为固冲汤具有的补肾固冲摄血、疏肝健脾的功效，故可用于治疗慢性肾炎。

固冲汤由白术、生黄芪、龙骨、牡蛎、山萸肉、生白芍、海螵蛸、茜草、棕榈炭、五倍子组成，具有固冲摄血、补脾益肾的功效。方中山萸肉味酸而温，兼具收敛固涩、补益肝肾及通经络的作用，为君药。龙骨甘涩，牡蛎咸涩，煅用收涩之效更强，合用以助君药固涩滑脱，为臣药。张锡纯常将此三药共用，作为收敛止血或救元气欲脱的常用配伍。白术益气健脾固冲，黄芪补气升提，合用使脾气旺而统摄有权。在糖尿病肾病模型大鼠实验中发现，黄芪能够诱导肾脏成纤维细胞c-met表达增加，从而达到抑制TGF-β1的表达[9]。另有报道，黄芪有效成分黄芪多糖能够抑制肾脏TGF-β1/Smads信号通路的活性，从而减少蛋白尿，降低血肌酐，保护肾功能[10]。生白芍有养血、敛阴、缓中之功，现代药理证实，其有效成分白芍总苷具有免疫抑制作用，能够抑制炎性因子，改善炎症状态，达到保护肾脏的作用[11]。棕榈炭、五倍子收敛止血，海螵蛸、茜草固涩止血兼化瘀，止血却不留瘀，均为佐药。全方脾肾兼顾，固涩和补益相结合，固涩止血的同时，又止血不留瘀，固涩摄血和化瘀相结合，共奏固冲摄血，益气健脾之功。

IgA肾病是以IgA为主的免疫复合物弥漫沉积在肾小球系膜区及血管袢的临床综合征，而肾脏病理检查则是评估肾小球损害程度的重要手段。本研究中，正常组大鼠肾组织未见明显异常，而模型组、固冲汤组、福辛普利组大鼠肾脏病理可见肾小球炎症反应，系膜增生，肾小球周围管腔变窄、出血，肾小管上皮细胞肿胀，部分肾小管壁呈空泡样，肾小球糖原增多。但福辛普利组和固冲汤组大鼠肾小球损害程度明显轻于模型组，可见固冲汤能够使IgA肾病模型大鼠肾组织病理变化程度明显减轻，起到保护肾脏的作用。

TGF-β1是由T细胞、脂多糖分泌的一种多功能细胞因子，可以与细胞表面的TGF-β1受体结合而激活其受体[2]。TGF-β1对间充质起源的细胞起刺激作用，而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用[12]，其主要功能是抑制淋巴细胞的分化，促进成纤维细胞、成骨细胞和雪旺氏细胞的生长，抑制免疫活性细胞的增殖，促进细胞外基质(ECM)如胶原蛋白、纤黏连蛋白的表达和抑制ECM的降解，对细胞形态的增殖和分化过程起着重要作用[13-14]。TGF-β1对早期的组织损伤具有修复及再生的作用，但若过度表达可导致肾组织反复损伤。在肾脏，TGF-β1主要位于肾小球、肾小管、肾间质，TGF-β1对疾病进程的影响是通过诱导肾小球系膜细胞及足细胞凋亡来实现的[4]。另有研究发现，TGF-β1可加速细胞外基质的生成及沉积，加重肾小管间质病变，刺激肾小球硬化，进而使IgA肾病趋向恶化发展[5]。李海剑等[15]的临床研究发现，IgA患者Haas分型、Katafuchi分级与肾组织中TGF-β1呈正相关，是病情恶化的重要因素之一。樊平等[16]关于老年IgA肾病患者的研究显示，患者组织、血液及尿液中TGF-β1水平显著升高，且与疾病严重程度呈正比。于建军等[17]将100例IgA肾病患者根据Lee氏分级分为轻、中、重3组，分别检测血液中TGF-β1水平，结果显示，根据病情进展，TGF-β1水平进行性升高，也证明TGF-β1水平与IgA肾病严重程度呈正相关。而关于儿童IgA肾病的相关文献亦报道，TGF-β1在儿童患者的尿液中表达较正常组明显增加，且较血液检测敏感[18]。以上研究均表明，TGF-β1不仅是肾小球损伤的标志，而且可以用于预测IgA肾病转归与预后。本研究显示，IgA肾病模型大鼠肾组织TGF-β1含量明显升高，而固冲汤可降低模型组大鼠肾组织TGF-β1含量。

综上所述，固冲汤对肾脏的保护作用可能与抑制肾脏TGF-β1的表达，抑制细胞外基质的生成，减轻肾小管间质病变有关，从而达到缓解疾病进程的目的。结果表明，固冲汤对肾脏保护机制可能与抑制TGF-β1的表达，减少细胞外基质生成有关。