基于HPLC多组分定量测定结合化学计量学的慢支固本颗粒质量评价

姚建华，赵 博，王婧宁，赵志国，韦 杏，黄 群*

0 引言

慢支固本颗粒由黄芪、防风、白术和当归组方而成，主要用于慢性支气管炎缓解期因肺脾气虚而出现的乏力、自汗、恶风寒、咳嗽、咯痰、易感冒、食欲不振等病症的治疗，对呼吸道细菌感染、支气管哮喘具有一定的治疗作用[1]。慢支固本颗粒现收载于中国药典2020年版一部[1]，质量标准和文献报道仅对其所含的1～2个成分进行了定量控制，不能全面地反映制剂的整体质量[2]。为更好地保障临床用药的稳定性和疗效一致性，本研究依据中医君、臣、佐、使配伍原则，结合中药质量标志物确认原则，采用HPLC法对慢支固本颗粒中8种主要成分的含量同时进行测定，以期建立多指标的慢支固本颗粒控制方法，同时采用SPSS 26.0统计软件对定量结果进行聚类分析和主成分分析，为全面评价慢支固本颗粒整体质量提供科学数据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；KQ-250DB型超声波清洗器(功率250 W，频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)；XS105DU型电子分析天平(精度：0.01 mg，德国Mettler Toledo公司)。

1.2 试剂 对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号111920-201907，质量分数96.8%，CAS号20633-67-4)、升麻素苷(批号111522-201913，质量分数94.6%，CAS号80681-45-4)、白术内酯Ⅲ(批号111978-201501，质量分数99.9%，CAS号73030-71-4)、白术内酯Ⅰ(批号111975-201501，质量分数99.9%，CAS号73069-13-3)，购于中国食品药品检定研究院；对照品9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷(批号PRF8101143，质量分数99.1%，CAS号94367-42-7)、芒柄花苷(批号PRF8081121，质量分数99.6%，CAS号486-62-4)、毛蕊异黄酮(批号PRF8062601，质量分数99.6%，CAS号20575-57-9)、升麻素(批号PRF9092523，质量分数99.7%，CAS号37921-38-3)，购于成都普瑞法科技开发有限公司。慢支固本颗粒(规格：每袋装10 g；批号：20190203、20190207、20190211、20190215、20190302、20190501、20190503、20190504、20190506和20190507，编号分别为S1～S10)来源于浙江新光药业股份有限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、升麻素苷、升麻素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ对照品各适量，用甲醇制成质量浓度分别为0.498、0.264、0.372、0.196、1.498、0.534、0.158和0.112 mg/ml的混合对照品储备液。精密吸取上述溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，分别用甲醇定容至20 ml，制成6个系列质量浓度线性考察用混合对照品溶液；取中间质量浓度混对溶液作为混合对照品溶液(毛蕊异黄酮葡萄糖苷24.9 μg/ml、芒柄花苷13.2 μg/ml、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷18.6 μg/ml、毛蕊异黄酮9.8 μg/ml、升麻素苷74.9 μg/ml、升麻素26.7 μg/ml、白术内酯Ⅲ 7.9 μg/ml、白术内酯Ⅰ 5.6 μg/ml)。

2.1.2 慢支固本颗粒供试品溶液 取慢支固本颗粒样品适量，剪开内包装，倾出内容物研细，取1.0 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加入甲醇适量，超声提取30 min，放冷后用甲醇定容，摇匀，滤过，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按慢支固本颗粒质量标准项下处方工艺，分别制备缺黄芪、缺防风、缺白术的阴性样品，再按上述方法制成3种阴性样品溶液。

2.2 色谱条件及专属性试验 采用Agilent SB C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脱，见表1；流速为0.9 ml/min；检测波长：254 nm(0～35 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、升麻素苷和升麻素)[3-8]和220 nm(35～55 min检测白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ)[9-12]；柱温为30 ℃；进样量为10 μl。精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μl，进样检测并记录色谱图(图1)。结果理论板数按各成分色谱峰计均>4 000，8种成分色谱峰分离效果良好，分离度均>1.5，阴性样品对8种成分同时测定无干扰。

图1 HPLC色谱图

表1 梯度洗脱程序

2.3 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下6个系列质量浓度线性考察混合对照品溶液适量，依次进样测定慢支固本颗粒中8种目标化合物的峰面积，以各成分质量浓度(X，μg/ml)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得8种目标化合物的回归方程、r值及线性范围，见表2。

表2 慢支固本颗粒中8种成分线性关系

2.4 精密度试验 取同一份慢支固本颗粒供试品溶液连续进样6次，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、升麻素苷、升麻素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的峰面积，结果8种目标化合物峰面积的RSD分别为0.88%、1.01%、0.95%、1.14%、0.52%、0.79%、1.06%和1.23%。

2.5 重复性试验 取同一批慢支固本颗粒样品，平行制备6份供试品溶液，依法进样检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、升麻素苷、升麻素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的峰面积并计算各成分含量，结果8种成分含量的RSD分别为1.45%、1.62%、1.30%、1.51%、0.89%、1.08%、1.73%和1.86%。

2.6 稳定性试验 取同一份慢支固本颗粒供试品溶液于0、2、4、9、18和24 h进样检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、升麻素苷、升麻素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的峰面积，结果显示，慢支固本颗粒供试品溶液24 h内稳定，供试品溶液中8种目标化合物峰面积的RSD分别为0.90%、1.03%、1.01%、1.12%、0.58%、0.82%、1.11%和1.19%。

2.7 加样回收率试验 取8种成分含量均已知的同一批次慢支固本颗粒样品适量，倾出内容物研细，取9份，每份0.5 g，精密称定，精密加入根据8种成分含量另行配制的混合对照品溶液(毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.326 mg/ml、芒柄花苷0.198 mg/ml、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷0.262 mg/ml、毛蕊异黄酮0.138 mg/ml、升麻素苷1.074 mg/ml、升麻素0.372 mg/ml、白术内酯Ⅲ 0.108 mg/ml、白术内酯Ⅰ 0.084 mg/ml)0.5、1.0、1.5 ml，再按供试品溶液制备方法制成加样回收样品溶液，依法进样测定，计算各成分含量及加样回收率，结果见表3。

表3 慢支固本颗粒中8种成分的回收率实验结果

续表

2.8 样品含量测定 取10个批次慢支固本颗粒样品，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，依法进样检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、升麻素苷、升麻素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的峰面积，计算8种目标化合物含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果(mg/g)

2.9 化学计量学分析

2.9.1 聚类分析 为考察不同批次间慢支固本颗粒的含量差异，采用SPSS 26.0软件组间联接聚类分析方法，以欧氏距离为测度，以8种目标化合物毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、升麻素苷、升麻素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ含量为变量，对10个批次慢支固本颗粒样品进行聚类分析，结果见图2。由图2可知，当类间距离为15时，10批样品聚为2类，样品S2、S5、S4、S1和S3聚为第Ⅰ类，样品S6、S9、S7、S10和S8聚为第Ⅱ类。从分类结果可以看出，目标化合物含量差异与样品批次期间相关，可能与慢支固本颗粒生产所用原药材的产地来源、采收时节不同以及原药材的批间质量差异有关。

图2 10批慢支固本颗粒聚类分析树状图

2.9.2 主成分分析 采用SPSS 26.0软件，以8种目标化合物含量为变量，对10个批次慢支固本颗粒含量数据进行主成分分析，得初始特征值和方差贡献率见表5。

表5 主成分特征值和方差贡献率

由表5可知，按照特征值>1，累积方差贡献率>85%为提取标准，从慢支固本颗粒8种目标化合物中提取出前3个主成分进行分析评价。由表5可知，升麻素苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、白术内酯Ⅲ、毛蕊异黄酮、白术内酯Ⅰ和毛蕊异黄酮葡萄糖苷是对主成分1影响较大的特征向量；升麻素对主成分2贡献度高，芒柄花苷对主成分3贡献度显著。见表6。

表6 10批慢支固本颗粒主成分分析结果

3 讨论

3.1 定量目标成分的选择 慢支固本颗粒由黄芪、防风、白术和当归4味中药材加工而成，方中黄芪补脾益肺、益气固表，为君药；白术健脾益气、

利水止汗，助君药黄芪补益脾肺，为臣药；当归补血和血，防风祛风解表、胜湿止痛，共为佐使药，诸药合用，共奏补肺健脾、固表和营之效。本文选取慢支固本颗粒君药黄芪所含活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和毛蕊异黄酮，臣药白术所含主要活性成分白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ，佐药防风所含代表性成分升麻素苷、升麻素为定量测定目标成分，以期更加全面地评价慢支固本颗粒的整体质量。

3.2 流动相的优化 在流动相优化过程中，首先对不同有机相(甲醇、乙腈)进行对比分析，结果显示甲醇-水体系[6-8]色谱图基线不平稳，部分色谱峰拖尾严重，达不到定量检测要求，而乙腈-水体系[11-13]基线稍平稳，但升麻素苷色谱峰出现拖尾现象。为有效改善峰形，采用乙腈为流动相中有机相，对不同水相(0.1%甲酸溶液[3-4,14-15]、0.1%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液[10,16]、0.2%磷酸溶液)进行对比分析，同时对有机相和水相比例进行多次优化，最终选择“2.4”项下的色谱条件。

中药及其制剂，尤其是中成药复方制剂相比于化学药品，质量控制方法比较滞后，控制体系尚不完善，制剂生产所用原药材因种属来源、产地差异、生长年限、采收季节等因素影响，造成中药制剂批间差异较大。从10批次样品含量测定结果来看，8种目标化合物含量存在一定批间差异，编号S4、S5和S2样品的8种目标化合物综合含量较高，编号S9和S6样品综合含量较低，与聚类分析结果一致。本实验采用HPLC法对慢支固本颗粒中8种成分含量同时进行测定，建立该制剂多指标成分质量控制模式，同时采用聚类分析、主成分分析等化学计量学手段对测定结果进行综合评价，有助于药品生产企业不断完善制剂制备过程参数控制以及对原药材内控质量标准的提升，为慢支固本颗粒质量控制体系的建立提供参考。中药指纹图谱具有信息量大、特征性强等特点，能够呈现中成药复方制剂所含更多化学成分信息，采用指纹图谱结合化学计量学方法对该制剂进行综合评价正在进一步研究中。