尼莫地平保护神经细胞缺氧损伤的机制探讨

赵建波，刘 峰，孙 亮

0 引言

慢性脑缺血缺氧能引起脑细胞损伤，甚至脑部病变，如脑组织水肿、软化及坏死等[1]。而许多疾病，如脑梗死、颈部血管斑块或堵塞、脑血管硬化等均可导致脑部缺氧，进而损伤神经细胞，加重病情[2-3]。因此，如何防治慢性脑部缺氧具有重要意义。尼莫地平(Nimodipine，NP)作为脂溶性的双氢吡啶类钙离子拮抗药，易通过血脑屏障并与中枢神经的特异受体结合，起到扩张脑血管和增加脑血流量的作用[4]。在临床上，NP已被应用于保护缺血性神经元、改善脑循环及治疗血管性痴呆等[5]。LINK-A是长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)的家族成员之一，分子量约为1.5 kb，亚细胞定位于细胞质[6]。研究显示，lncRNA LINK-A与多种肿瘤细胞恶性进展有关[7]。还有研究显示，lncRNA LINK-A可能通过激活HIF1α信号通路改善糖尿病性肾病的治疗[8]。但lncRNA LINK-A是否参与NP对缺氧诱导的神经细胞的保护还未见报道。本研究以SK-N-SH细胞作为研究对象，通过三气培养箱构建缺氧环境，观察NP对缺氧神经细胞的保护作用，并探讨lncRNA LINK-A在其中的作用，为临床治疗慢性脑缺氧提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞购自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 NP(货号N149，纯度≥98%)购自美国Sigma-Aldrich公司，以DMSO配制母液；TUNEL染色试剂盒、噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS)、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物公司；MEM培养基、青-链霉素、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司；lncRNA LINK-A过表达慢病毒转染试剂盒购自上海吉玛公司；反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司；Bcl-2抗体、p-AKT抗体、AKT抗体及GAPDH抗体购自美国CST公司；抗兔IgG、HRP二抗购自上海爱必信公司。

1.1.3 主要仪器 电子天平，美国赛多利斯公司产品；SpectraMax 190酶标仪，美国Molecular Devices公司产品；Centrifuge 5424 R高速冷冻离心机，德国eppendorf公司产品；Mx3000/Mx3005P 实时荧光定量PCR仪器，美国安捷伦公司产品；IX73倒置显微镜，日本奥林巴斯公司产品；SQP-30/SQ三气培养箱，天津玛福尔科技有限公司产品；AI600凝胶成像仪，美国GE公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和培养环境 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞以含10%FBS和1%青-链霉素的MEM培养基培养。细胞正常培养环境为饱和湿度、37 ℃、95%空气、5%CO2的培养箱。缺氧环境为饱和湿度、92%N2、5%CO2和3%O2的三气培养箱。

1.2.2 MTT法检测细胞存活率 接种细胞于两张96孔板中，每孔8×103个细胞。次日，配制含0、5、10、20、40、80、160 μmol/L NP的MEM培养基，取一个96孔板，每孔按100 μl上述培养基加入细胞中，每个浓度设置5个复孔，同时设立调零孔，置于缺氧环境中。另一孔板每孔加入100 μl MEM培养基，作为对照置于正常环境中。细胞培养24 h时，每孔加入MTT (5 mg/ml)10 μl，继续培养4 h。而后弃去培养基和MTT混合液，每孔加入二甲基亚砜100 μl。用酶标仪于490 nm处测定各孔的吸光度(OD)，计算细胞存活率。

1.2.3 慢病毒转染法构建lncRNA LINK-A稳定表达的SK-N-SH细胞 接种3×106个细胞于6孔板中，次日，取出带绿色荧光标签的空载慢病毒液和lncRNA LINK-A过表达慢病毒液，分别稀释20倍备用。配制含10 μg/ml Polybrene的MEM全培养基并替换旧培养基，将2种慢病毒液分别加入细胞中并设为空载对照组和LINK-A过表达组，以正常SK-N-SH细胞作为空白组。37℃、5%CO2培养箱中培养20 h，更换新的MEM全培养基，生长至对数期传代于6 cm培养皿中，嘌呤霉素筛选细胞。荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况，RT-qPCR检测lncRNA LINK-A表达水平。

1.2.4 生化仪检测细胞LDH释放率 接种SK-N-SH细胞于2个6孔板中，每孔3×105个细胞。次日，将一孔板置于正常环境中，作为空白组；将另一孔板分为2组，分别为缺氧组和NP组，置于缺氧环境中。空白组和缺氧组以1‰DMSO处理，NP组以NP (20 μmol/L)处理，时间为24 h。另将转染成功的空载对照组和LINK-A过表达组，以及相应空白组细胞置于缺氧环境中24 h。按试剂盒说明书测定LDH水平，LDH释放率(%)=上清液LDH值/(上清液LDH值+细胞内LDH值)×100%。

1.2.5 TUNEL染色检测细胞凋亡情况 将无菌盖玻片置于六孔板中，每孔接种5×104个细胞。按“1.2.4”项中2种分组处理后PBS洗一遍，甲醇固定10 min，按说明书进行TUNEL染色，并以DAPI染核。荧光显微镜下观察拍照并计算细胞凋亡指数。

1.2.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNA LINK-A表达 收集空白组、缺氧组和NP组细胞，采用TRIZOL法提取细胞总RNA，测定RNA浓度后，以反转录试剂盒将RNA转为cDNA，cDNA稀释备用。将lncRNA LINK-A引物稀释，利用RT-qPCR试剂盒进行检测，每组设置3个复孔。采用2(-△△CT)法计算lncRNA LINK-A的表达水平。空载对照组、LINK-A过表达组、相应空白组也采用上述方法检测LINK-A表达水平。

1.2.7 蛋白印记实验检测p-AKT和Bcl-2蛋白表达 按“1.2.4”项中2种分组处理后，细胞以RIPA裂解液(含磷酸酶和蛋白酶抑制剂)提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，制备蛋白样品，并以30 μg/孔蛋白进行上样，PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，4 ℃孵育AKT(1∶2 000)、p-AKT(1∶1 000)、Bcl-2(1∶2 000)及GAPDH(1∶4 000)抗体过夜，次日洗膜后孵育抗兔IgG HRP二抗(1∶4 000)1 h，洗膜后以ECL发光液于凝胶成像仪上成像。

2 结果

2.1 NP对缺氧神经细胞存活率、LDH释放率及lncRNA LINK-A表达的影响 MTT结果显示，缺氧诱导SK-N-SH细胞存活率降低(P<0.01)。10～50 μmol/L NP均可抑制缺氧诱导的SK-N-SH细胞存活率下降(P<0.01)，其中，20 μmol/L NP的抑制效果最强，见图1A。对照组、缺氧组及NP组LDH释放率分别为18.6%±2.2%、69.5%±6.3%及42.9%±5.0%。与对照组比较，缺氧组LDH释放率显著升高(P<0.01)；与缺氧组比较，NP组LDH释放率明显降低(P<0.01)，见图1B。RT-qPCR结果显示，对照组、缺氧组和NP组lncRNA LINK-A表达分别100%、33.6%±3.0%、538.3%±43.6%。相较于对照组，缺氧组lncRNA LINK-A表达明显降低(P<0.01)；与缺氧组相比，NP组lncRNA LINK-A表达显著上调(P<0.01)，见图1C。

图1 NP对缺氧神经细胞活力、LDH释放率及lncRNA LINK-A表达的影响

2.2 NP抵抗缺氧诱导的神经细胞凋亡 TUNEL染法结果显示，对照组、缺氧组和NP组细胞凋亡指数分别为12.60%±0.11%、65.50%±5.80%、40.62%±3.85%。与对照组相比，缺氧组细胞凋亡显著增加(P<0.01)；与缺氧组比较，NP组细胞凋亡明显降低(P<0.01)，见图2。

图2 对照组、缺氧组和NP组细胞凋亡水平

2.3 NP逆转缺氧诱导的p-AKT和Bcl-2蛋白表达下调 蛋白印记结果显示，对照组、缺氧组和NP组p-AKT相对蛋白表达分别为100%、58.3%±6.5%、106.5%±8.6%，Bcl-2蛋白表达分别为45.6%±6.5%、10.2%±1.2%、96.6%±8.2%。与对照组相比，缺氧组细胞p-AKT和Bcl-2蛋白表达明显下调(P<0.01)；与缺氧组相比，NP组细胞p-AKT和Bcl-2蛋白表达显著上调(P<0.01)，见图3。

图3 对照组、缺氧组和NP组细胞p-AKT与Bcl-2相对蛋白表达

2.4 lncRNA LINK-A过表达抵抗缺氧诱导的神经细胞LDH释放率增加 荧光显微镜观察显示，空载对照组和LINK-A过表达组均显绿色荧光，见图4A。RT-qPCR结果显示，相较于空载对照组，LINK-A过表达组细胞lncRNA LINK-A表达明显升高(P<0.01)，见图4B。空白对照组、空载对照组和LINK-A过表达组LDH释放率分别为73.6%±7.8%、70.5%±8.1%、32.3%±3.6%。与空载对照组相比，LINK-A过表达组LDH释放率显著降低(P<0.01)。见图4C。

图4 lncRNA LINK-A过表达对缺氧神经细胞LDH释放率的影响

2.5 lncRNA LINK-A过表达抵抗缺氧诱导的神经细胞凋亡 空白对照组、空载对照组和LINK-A过表达组在缺氧环境中生长24 h，TUNEL染色结果显示，各组细胞凋亡指数分别为44.7±4.1、48.6±5.12、28.8±1.83。与空载对照组相比，LINK-A过表达组细胞凋亡显著降低(P<0.01)，空白对照组与空载对照组差异无统计学意义。

2.6 lncRNA LINK-A过表达诱导p-AKT和Bcl-2蛋白表达上调 蛋白印记结果显示，空白对照组、空载对照组和LINK-A过表达组p-AKT相对蛋白表达分别为100%、98.9%±8.9%、426.3%±40.6%，Bcl-2蛋白表达分别为82.3%±8.0%、85.5%±8.9%、356.6%±38.2%。空白对照组和空载对照组间差异无统计学意义(P>0.05)，与空载对照组相比，LINK-A过表达组p-AKT和Bcl-2蛋白表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)，见图5。

图5 空白对照组、空载对照组和LINK-A过表达组细胞凋亡情况

图6 lncRNA LINK-A过表达对p-AKT和Bcl-2蛋白表达的影响

3 讨论

脑缺氧指氧的供应或利用不能达到脑组织代谢需要的最低水平而出现不同程度的脑功能障碍，而慢性脑缺氧会造成不可逆转的脑损害，甚至脑死亡[9]。许多因素可引起脑缺氧，如脑血管硬化、脑梗死、手术损伤、肿瘤、炎症等[10]。通常情况下，慢性脑缺氧会引起线粒体功能障碍、钙离子超载、氧化应激及炎症反应等一系列病理变化，进而诱导神经细胞损伤而导致细胞凋亡[11-12]。研究显示，神经细胞凋亡与神经退行性疾病，如阿尔茨海默症和肌肉萎缩性侧索硬化症等疾病发生发展密切相关[13-14]。因此，防治缺氧性神经细胞损伤或凋亡对于改善或预防脑血管或脑神经相关疾病具有重要临床意义。

SK-N-SH细胞为人神经母细胞瘤细胞，具有神经细胞的特性和肿瘤细胞无限增殖的能力，广泛应用于神经细胞相关研究。本研究以SK-N-SH细胞作为研究对象，发现10～50 μmol/L NP可抵抗缺氧诱导的SK-N-SH细胞存活率降低，而且20 μmol/L NP的效果最佳，提示NP对缺氧环境中的SK-N-SH细胞具有保护作用，由于20 μmol/L NP药效最佳，该浓度的NP被选用于后续实验。进一步研究发现，NP处理可抵抗缺氧诱导的SK-N-SH细胞LDH释放率和凋亡增加。LDH存在于机体所有组织细胞胞质内，而缺氧损伤后细胞膜通透性改变，LDH易渗出细胞外，导致LDH释放率增加[15]，提示NP可减轻缺氧诱导的SK-N-SH细胞损伤和凋亡。相关分子研究发现，缺氧可诱导SK-N-SH细胞Bcl-2和p-AKT蛋白表达下调，而NP可逆转上述蛋白表达变化。Bcl-2作为抗凋亡蛋白，在细胞凋亡中发挥抗凋亡作用[16]。研究显示，AKT的磷酸化激活可减少细胞凋亡[17]。提示NP可能通过诱导缺氧神经细胞p-AKT和Bcl-2蛋白表达上调抵抗细胞凋亡。

缺氧条件下，SK-N-SH细胞LINK-A表达显著降低，而NP处理能上调LINK-A表达水平。提示LINK-A可能在NP减缓缺氧诱导的SK-N-SH细胞损伤中发挥作用。

为了进一步验证LINK-A的生物学功能，本研究成功构建了LINK-A过表达的SK-N-SH细胞。结果发现，lncRNA LINK-A过表达能抑制缺氧诱导的SK-N-SH细胞LDH释放和细胞凋亡，还能上调Bcl-2和p-AKT蛋白表达。提示lncRNA LINK-A可能作为Bcl-2和p-AKT蛋白的上游调控因子，参与抵抗缺氧诱导的SK-N-SH细胞凋亡。

综上所述，NP可能通过lncRNA LINK-A诱导p-AKT和Bcl-2蛋白表达上调，从而抵抗缺氧诱导的SK-N-SH神经细胞凋亡。但本研究仅仅是体外缺氧模拟实验，还有待于进一步体内实验进行验证。