GRIN1突变相关发育迟缓患儿临床特征和基因突变特点分析

卢亚亚， 丁 宇， 姚如恩， 王依柔，张倩文， 李 群， 王 剑， 王秀敏， 娄 丹

（1.河南科技大学第一附属医院儿科，河南 洛阳 471000；2.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心内分泌代谢科，上海 200127；3.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心分子诊断实验室，上海 200127）

兴奋性氨基酸受体是哺乳动物中枢神经系统重要的兴奋性神经递质受体，负责调节神经系统功能。谷氨酸（glutamic acid，Glu）在所有兴奋性氨基酸递质中含量最为丰富。Glu受体分为离子型和代谢型。离子型 Glu受体分为N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体和非NMDA受体[1]。NMDA受体是Glu受体的主要亚型，是由不同亚基构成的异四聚体，有3种亚基[NR1、NR2（NR2A-2D）、NR3（NR3A、NR3B）][2]。NMDA受体主要参与学习记忆、突触可塑性、兴奋性神经毒性等生理病理过程。GRIN1基因编码NMDA受体的NR1亚基。NR1亚基是基本功能亚单位，如缺失会严重影响NMDA受体的功能[3]。GRIN1基因变异可引起癫痫性脑病、精神发育迟缓、语言落后、肌张力减退、运动障碍、脑萎缩。该基因变异非常罕见。本研究对2例GRIN1基因新发突变患儿的临床表型及分子特征进行分析，探讨GRIN1基因突变在儿童发育迟缓中的价值。

1 材料和方法

1.1 病例介绍

病例1，女，1岁，以“发育迟缓数月”为主要症状就诊。患儿系第2胎第2产，足月自然分娩出生，出生时无窒息抢救史，出生体质量3.0 kg。当地医院的新生儿临床检查未发现异常。4月龄时，因不会抬头至当地医院进行检查，体检发现患儿无追视，不会对人微笑，双下肢肌张力低，膝腱反射正常。实验室检查结果：肝、肾功能正常，血氨及乳酸正常，肌酸激酶及其同工酶正常，血常规、尿常规、粪便常规、血糖、血电解质、25-羟基维生素D3均无异常，串联质谱检查所有氨基酸和酰基肉碱谱均无明显异常。头颅磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）检查正常。拟诊断：发育落后。当地医院给予综合康复及对症支持治疗，症状无改善。患儿12月龄时至上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心内分泌医学遗传联合门诊就诊。体格检查：身高76 cm，体质量9 kg，头围44 cm，无特殊面容，对人和物无反应，抬头不稳，不会独坐，不会翻身，无咿呀作语，心、肺听诊无异常，右耳听力检查欠佳，视力正常。头颅MRI检查未见异常。染色体核型、肝功能、碱性磷酸酶、葡萄糖、乳酸、电解质和尿液分析均正常。血氨、乳酸、血清游离钙检测结果及血液串联质谱分析均正常。

病例2，男，7岁4个月，以“发现身材矮小数年并发育迟缓”为主要症状就诊。患儿系第1胎第1产，足月自然分娩出生，出生时无窒息抢救史，出生体质量3.3 kg，当地医院新生儿临床检查无异常，逐渐出现发育落后，伴生长速率减慢，具体不详。当地医院实验室检查结果：血常规、尿常规、粪常规、肝功能、肾功能、血氨、乳酸、肌酸激酶及其同工酶、血糖、血电解质无异常，串联质谱检查所有氨基酸和酰基肉碱谱均无明显异常，头颅MRI平扫正常。拟诊断：发育落后、矮小症。给予对症支持治疗，症状改善缓慢，发育仍明显落后于正常同龄儿童。患儿7岁4个月时至上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心内分泌医学遗传联合门诊就诊。体格检查：身高116 cm，体质量18.4 kg，头围49 cm，对人和物有反应，行走自如，会单脚跳，简单词汇，不能连成句，心、肺听诊无异常，四肢活动可，视力正常，听力正常。头颅MRI检查未发现异常。染色体核型、肝功能、碱性磷酸酶、葡萄糖、乳酸、电解质和尿常规检测均正常。甲状腺功能正常，胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor 1，IGF-1）99.4 ng/mL（降低），胰岛素样生长因子结合蛋白-3（insulinlike growth factor-binding protein 3，IGFBP-3）3.96 μg/mL（降低），血氨、乳酸、血清游离钙检测结果均正常。

本研究经上海交通大学附属上海儿童医学中心伦理委员会审查批准，患儿监护人均知情同意。

1.2 方法

采集2例患儿及父母外周血，用Lab-Aid DNA分离试剂盒（厦门致善生物科技股份有限公司）抽取DNA，使用Qubit 2.0 荧光计（美国Life Technologies公司）测定DNA浓度，-20 ℃保存。采用SureSelect靶序列富集试剂盒（美国Agilent公司）制备接头连接的文库，采用包含2 742个基因的XT Inherited Disease panel（美国Agilent公司）制备并获得捕获文库，通过IlluminacBot工作站（美国Illumina公司）的等温桥式扩增产生DNA簇，最后用HiSeq 2500系统（美国Illumina公司）进行靶向基因测序（targeted gene sequencing，TGS）。目标区域平均测序深度为135×，20×以上区域为98.85%。测序数据经Sequence Control软件（美国Illumina公司）评估，合格后采用NextGENe软件对数据进行初步处理，然后采用Variant Analysis软件（美国Ingenuity Systems公司）进行生物信息学分析。选择脑发育异常的临床症状作为筛选候选变异的指标。对筛查出的基因进行Sanger测序验证。

2 结果

2.1 2例发育迟缓患儿基因检测结果

病例1：GRIN1基因存在“错义变异c.1672T＞G，p.Phe558Val（杂合）”，患儿父母亲该位点为正常基因型。该变异为新发现的变异，经Alamut功能软件（瑞士SOPHiA GENETICS公司）预测可能会影响蛋白结构域的功能。按美国医学遗传学和基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomic，ACMG）变异分类标准，归类为“可能致病性”变异。见图1。

病例2：GRIN1基因存在“错义变异c.1852G＞A，p.Gly618Ser（杂合）”。患儿父母亲该位点为正常基因型。该变异为新发现的变异，经Alamut功能软件预测可能会影响蛋白结构域的功能。按照ACMG变异分类标准，归类为“可能致病性”变异。见图1。

图1 2例发育迟缓患儿及其父母GRIN1基因序列

2.2 临床随访

病例1随访至2岁，期间排除其他器官、系统畸形，行心脏、腹部超声等均未见异常。行康复治疗，全身肌张力低下，运动发育迟缓，不能独坐，可伸手取远处物品，有眼神交流，不会说话。身高、体质量与同年龄儿童相仿。

病例2随访至8岁，身高增长至119 cm，智力发育无明显改善，明显落后于正常同龄儿童。

2.3 文献报道的GRIN1基因突变类型和患儿临床表现分析

对本研究的2例及文献报道的37例GRIN1基因突变相关发育落后患儿的GRIN1基因突变类型和临床表现进行分析，具体见图2及表1。

图2 GRIN1基因突变区域分布

表1 GRIN1基因突变患儿的临床表型分析

续表1

3 讨论

智力障碍或全面发育迟缓是一大类具有高度临床和遗传异质性的神经发育障碍性疾病，常共患孤独症谱系障碍、注意缺陷多动障碍等多种精神行为障碍，是全球儿童致残的主要原因之一，其病因复杂，涉及遗传和环境等多种因素[13]。近年来，随着基因检测技术在临床实验室的广泛应用，一些与婴幼儿发育迟缓相关的基因备受关注。矮小症是指与同地区、同年龄、同性别正常儿童比较，身高位于正常儿童生长曲线的第3百分位数以下[14]。有诸多原因会影响儿童生长，导致儿童矮小，如遗传、营养、环境、精神心理因素、下丘脑-垂体-胰岛素样生长因子轴异常、染色体畸变、全身性慢性疾病、遗传代谢病以及内分泌因素等。矮小合并畸形或发育异常者需要警惕遗传代谢性疾病[15]。

本研究2例GRIN1基因突变引发发育迟缓的患儿中有1例同时合并矮小症。GRIN1基因突变引发发育迟缓极为罕见，目前仅报道30余例，尚未见合并矮小症的报道。结合文献报道，包括本研究2例患儿在内的39例患儿的共同临床特征为发育迟缓、认知障碍、不同程度的智力受损等[4-12]。多数[72.2%（26/36）]患儿无自行行走能力，本研究病例1有此表现。部分患儿还表现为刻板运动[2.6%（1/39）]和眼动障碍[12.8%（5/36）]，本研究2例患儿均无此表现。其他临床表现还有：孤独症谱系障碍[20.5%（8/39）]、性格激进[2.6%（1/39）]、自残行为[2.6%（1/39）]、痛觉异常[2.6%（1/39）]、睡眠障碍[20.5%（8/39）]、喂养困难[23.1%（9/39）]、小头畸形[2.6%（1/39）]等，其中畸形是非特异性的临床特征[6-7]。本研究2例患儿均无以上表现。

GRIN1基因突变患者中大部分有癫痫史[43.6%（17/39）]。癫痫发作表现为多种类型，如全身性癫痫、局灶性癫痫、婴儿痉挛、强直癫痫、肌阵挛性癫痫和发热性癫痫等，癫痫发作时的年龄、脑电图类型和抗癫痫治疗效果有明显差异[6-7，9-11]。本研究2例患儿在随访期内均无癫痫发作，这与文献报道（突变位点相近的患儿无癫痫发作）[7]一致。考虑到GRIN1基因突变患儿癫痫初次发作的年龄有较大差异，本研究中有1例患儿年龄尚小，因此仍需长期随访。

N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）在正常的大脑发育和功能中起着重要作用。NMDAR亚单位的突变与多种癫痫综合征及一些神经发育障碍相关。由GRIN1基因编码的NMDAR NR1亚基包含4个结构域：（1）细胞外氨基末端结构域，主要调节离子通道开放和反应时间过程；（2）ATD；（3）具有4个疏水段（M1～M4）的TMD；（4）CTD，参与定位和细胞内信号转导[1]。NR1亚基的激活涉及几个调节因素机制。NR1亚基上存在NMDAR激动剂之一的甘氨酸（glycine，Gly）结合位点。NR2亚基上的Glu结合位点通过结合Glu触发调节向内电流阳离子选择孔的打开，从而导致神经元去极化和细胞内钙离子流入增加[16]。NMDAR的激活需要激动剂Gly的辅助。NR1亚基与NR2亚基结合后才能形成具有高度活性功能的NMDA通道，调节钙离子的内流。NMDAR也有几种负调节方式，包括电压依赖型细胞外镁离子、细胞外离子及内源性细胞外锌离子[1]。

本研究和文献报道的39例患儿中，GRIN1基因突变复合杂合变异32例、纯合变异7例。患儿预后：有3例死亡，死亡患儿出生后即出现难以控制的癫痫，死亡时年龄较小，其他36例表现为不同程度的智力发育迟滞、运动障碍等。

大多数GRIN1基因突变靠近或集中于构成固有离子通道的4个TMD受体的区域（图2）。TMD区域的突变与离子孔破裂有关，表现为功能失调或缺乏功能[4]。本研究病例1发现的新突变p.Phe558Val在连接配体结合区（ligandbinding domain，LBD）和TMD的前M1区，可能在传递配体信息中起作用，诱导LBD到TMD的结构变化。因此，p.Phe558Val突变可能影响NMDAR的功能，进而出现神经系统损伤的临床表现。病例2的p.Gly618Ser变异位于跨膜区，对于p.Gly618和p.Gly620位点的突变，有模型预测可能会影响Glu NR1亚基顺利进入对离子的选择性通过起决定作用的通道。因此，孔残基p.Gly618和p.Gly620转化为带电精氨酸侧链可能对NMDA通道属性有很大的影响[8]。NMDAR的NR1亚基出现突变，会影响神经元去极化和细胞内钙离子的流入超载，导致相关神经元功能损伤。

有研究结果显示，在仅表达Glu NR1正常水平5%～10%的GRIN1突变亚型小鼠模型中，小鼠的刻板行为增加，具有R844C纯和突变的GRIN1突变小鼠模型具有多动、社会互动减少、惊吓反应及异常的焦虑样行为[17-18]。尽管这些小鼠模型的行为异常与本研究的杂合子患儿不完全相似，但表明GRIN1基因突变可能在2个物种的社会和认知行为中起着相似的作用。

GRIN1突变具有相似的临床特征。但PADEROVA等[12]报道的1例GRIN1基因突变的9岁男孩，突变位点为c2470A＞T，患儿有严重的智力发育延迟和运动迟缓，肌张力减退、轻度小头畸形、小指的单侧畸形、短手指、手指垫突出、关节松弛，还具有特殊面容：长眼睑、眼睑下垂、蓝巩膜、斜视、高而窄颚弓、尖下巴、大耳、低位耳、耳廓畸形。这些临床特征与歌舞伎综合征类似，但缺乏歌舞伎综合征的分子基因诊断。其他NMDAR亚单位突变也有交叉重叠的临床表现，如GRIN2A基因突变与语言异常及一系列的癫痫性脑病有关。有研究结果显示，已知基因中致病性变异的表型表达可能与不同的遗传模式有关。目前尚未见编码NMDAR其他亚单位（如GRIN2A）基因的纯合或双等位变异的报道[19]。

综上所述，本研究发现了2例新的GRIN1基因突变引发的发育迟缓患儿，扩展了该基因变异的基因型和表型库。对于发育迟缓的患儿，排除继发因素后，应重视GRIN1基因突变的检测。完善该类患儿的基因检测，有助于明确病因，精准诊断，同时也有助于患儿及其父母的遗传咨询，做好产前诊断工作。