水产动物副溶血性弧菌的拮抗菌研究进展

冯艳琴， 万夕和， 沈 辉*， 李吉云， 蒋 葛， 乔 毅

(1. 江苏省海洋水产研究所，江苏 南通 226007；2. 江苏海洋大学 海洋生命与水产学院，江苏 连云港 222000；3. 南京师范大学 海洋科学与工程学院，江苏 南京 210000)

病害是制约水产养殖业发展的重要因素之一，我国每年因病害导致的水产经济损失高达数百亿元。水生动物病原主要包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等，其中细菌感染是影响水产养殖业的最重要因素之一[1]。在水产致病细菌中，副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是水产经济动物最常见的致病菌之一，主要来源于鱼、虾、蟹、贝、藻和其他水产品，能引起水生动物溃疡、炎症、死亡等。副溶血性弧菌是一种革兰阴性菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无芽胞，是食源性致病菌，可导致食物中毒并引起诸如急性腹痛和腹泻等症状[2]。近年来，一种新的病原菌可引起对虾急性肝胰腺坏死综合症(Acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND)，经鉴定为一类携带priA和priB毒力基因的副溶血性弧菌，该病原菌造成泰国、中国、越南等对虾主产国的对虾产量减半，已成为全球对虾产业的重要疾病之一[3-4]。目前，针对水产养殖细菌性疾病的防治方法主要有抗生素、噬菌体、中草药和拮抗菌等，不同方法具有不同的优势，也各自具有一定的局限性。如抗生素的不合理使用不仅易引发细菌耐药性，还会导致药物残留，降低养殖动物的免疫力，破坏水环境中微生物的生态平衡[5]；噬菌体的裂解较窄，杀菌广谱性较弱，并且存在一定的耐受性；中草药的治疗效果较为缓慢，且使用成本较高。与以上方法相比，拮抗菌具有高效、低风险等优点，利用其分泌的特殊代谢物质或改变环境条件抑制或杀灭有害微生物已经得到了广泛研究和应用[6-7]。本文就副溶血性弧菌目前拮抗菌的种类、筛选拮抗菌常用的方法、拮抗菌产生的活性物质种类、拮抗作用机制和发展应用前景进行综述，以期为水产动物副溶血性弧菌拮抗菌的研究提供参考。

1 副溶血性弧菌拮抗菌主要种类

在生态系统中，微生物之间存在着非常复杂的相互作用，常见的有种间共处、互生、共生、拮抗、竞争、寄生和捕食等。当一种微生物能够产生某种特殊的代谢产物或改变环境条件以抑制甚至杀死另一种微生物时被称为拮抗菌[7]。自然界中拮抗菌和拮抗作用无处不在，水产养殖过程中通常利用有益微生物对病原菌进行抑制及疾病防控[8]。副溶血性弧菌是水产养殖过程中常见的病原菌，关于该菌的拮抗菌有较多研究，主要集中在芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、交替单胞菌属(Alternomonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、光合细菌(Photosyntheticbacteria)、海洋放线菌(Marineradiobacterium)以及乳酸菌(Lactobacillus)等[9-10]。

1.1 芽胞杆菌

芽胞杆菌是一类能形成芽胞的杆菌或球菌，革兰阳性，广泛分布于土壤、水体、空气及动物肠道中。相关研究表明，芽胞杆菌科(Bacillus)下多种细菌对水产养殖疾病的预防和控制都有重要意义，其中对副溶血性弧菌有良好拮抗效果的菌种有枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)及莫海威芽胞杆菌(Bacillusmojavensis)等。芽胞杆菌可形成抗逆性强的芽胞、产生多种抗菌物质[11]、多肽、分泌挥发性脂肪酸(如乙酸、丙酸等)，具有很强的抑制革兰阳性菌和阴性菌的能力[12]，部分菌株还可产生抗菌蛋白质和抗生素，抑制和杀灭病原菌[13]。

自1986年以来，相关拮抗菌的研究就已有报道，Kozasa[14]从土壤中分离1株芽胞杆菌，发现对日本鳗鲡病原菌具有明显的抑制作用。Balczar等[15]从凡纳滨对虾肠道分离到对副溶血性弧菌有拮抗作用的枯草芽胞杆菌UTM126，该拮抗菌对溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和哈氏弧菌(Vibrioharveyi)也有明显的拮抗作用。杨胜远等[16]筛选出1株枯草芽胞杆菌JNT02，在改良兰迪培养基中24 h可完全杀灭共培养的副溶血性弧菌，其培养液的抗菌物质对其拮抗作用有累积效应。邓书香[17]筛选出1株地衣芽胞杆菌，对副溶血性弧菌有良好的拮抗作用，可用于拮抗菌制剂的开发。同样，韦露等[18]研究发现短小芽胞杆菌B1对副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等匀有显著的拮抗作用，共培养试验显示，加入等量短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)B1无菌上清液可显著抑制副溶血性弧菌的生长。刘雪飞[13]通过分离、筛选和鉴定，获得2株对副溶血性弧菌有拮抗作用的潜在益生菌——短小芽胞杆菌和莫海威芽胞杆菌(Bacillusmojavensis)，两株拮抗菌均能分泌胞外酶，且抗菌谱广，抑菌试验表现出良好的效果。

1.2 假交替单胞菌

假交替单胞菌是一类海洋细菌，为革兰阴性菌，广泛分布于深海，常附着于海洋高等动植物体表或体内，该属菌有菌毛和微荚膜，不形成芽胞，大部分能够产生多种具有较强的蛋白酶活性的胞外活性物质，也是重要的益生菌之一。相关研究表明，该菌属中的许多菌种对副溶血性弧菌具有拮抗作用。王树杉[19]从海水养殖环境分离出具有抑菌活性的细菌JG1，采用琼脂扩散法进行体外拮抗试验并测定其抗菌谱，结果发现菌株JG1抑菌谱较广，对多株海水养殖病原弧菌和气单胞菌(Aeromonas)有拮抗作用，经鉴定该株菌为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)。王春迪[20]针对南美白对虾急性肝胰腺坏死症副溶血性弧菌进行拮抗菌筛选，筛得m8和a22两株菌对该副溶血性弧菌有良好的拮抗作用，通过形态学特征、生理生化以及测序等方法鉴定m8和a22均为假交替单胞菌。于敏[21]从大菱鲆养殖海水中筛选的金丽假交替单胞菌(Pseudoalteromonasflavipulchra)JG1，对多个种属的细菌，如弧菌属、芽胞杆菌属等具有较强的抑菌活性，初步探讨了菌株JG1抑菌活性物质的合成途径及对不断变化的海洋环境的适应能力，并发现多个与抑菌活性相关或代谢产物合成相关的基因，丁质酶、密度感应信号分子降解酶等与抗微生物相关的编码基因，以及对氧化压力、重金属的抵抗及对抗生素或其他药物的抵抗相关的基因。

1.3 乳酸菌

乳酸菌是一类厌氧或兼性厌氧无芽胞的革兰阳性菌，是重要的益生菌，广泛应用于日常生活和养殖生产中[22]。乳酸菌在生长和代谢过程中可产生有机酸、乳酸和细菌素等代谢物质，并渗透至致病菌细胞内，从而抑制病原菌的生长；该菌株还可降低对虾肠道的pH值，阻止和抑制有害细菌定殖，增强机体抗感染能力[23-25]。Bussarin等[26]从高温处理后的健康对虾中分离到2株乳酸菌菌株，分别为肠道原著植物乳杆菌和外来乳酸短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，均对弧菌等病原菌有拮抗作用，并可作为耐热益生菌候选菌株添加到凡纳滨对虾饲料中，能较好地降低水环境中的病原菌数量，并改善水质。周海平等[27]使用平板稀释抑菌圈法，研究了乳酸杆菌LH代谢产物对一系列致病性弧菌，包括副溶血性弧菌等具有明显的抑制作用，在模拟养殖水体实验中取得了良好的效果。此外，乳酸杆菌具有提高动物的免疫力、调节肠道菌群的功能，还能产生一系列维生素、各种消化酶(蛋白酶等)、Y-氨基酸、胞外多糖、共轭亚油酸，这些乳酸菌分泌物或合成的胞外产物，可直接为宿主提供必要的营养成分，促进对虾的生长[28-30]。Chiu等[31]研究表明，投喂含植物乳杆菌(Lactobacillusplanterum)的饲料，可提高凡纳滨对虾的免疫能力和抗弧菌感染能力。文金顺[29]从海南热带海洋环境的223株土著菌株中筛选出2株乳酸菌，在养殖凡纳滨对虾拌料投喂的试验时发现，上述乳酸菌可适应对虾消化道环境，对病原性弧菌具有较强的拮抗作用，且对凡纳滨对虾无毒无害，为开发适用于凡纳滨对虾养殖的热带土著乳酸菌制剂提供参考。

1.4 海洋放线菌

海洋放线菌是一类具有高G+C含量的革兰阴性菌，可产生丰富的次生代谢活性产物[32-33]，属于中等耐盐菌，适于海洋环境条件。目前已发现的生物活性物质多源于海洋浅海区海底沉积物中的放线菌[34-35]。海洋放线菌通过抑制弧菌菌膜形成，预防和治疗因弧菌引起的对虾病害，具有较大的应用潜力[36]。Kesarcodi等[37]发现，海洋放线菌可产生抗菌物质，如耐热耐干燥的孢子、维生素及酶，以抑制病原菌的增殖，还可以降解对虾养殖水体中淀粉和蛋白质等大分子物质。You等[38-39]分离的海洋放线菌中，有66.1%可裂解弧菌细胞壁，63.8%含有蛋白酶，56.5%具有酯酶可降解弧菌生物膜，这些功能可能与其分泌的蛋白质水解酶或细菌细胞壁裂解酶有关，同时海洋放线菌可以降低虾体中抗性基因横向转移机会，降低了对虾致病微生物对抗生素的耐药性，这在对虾养殖中具有很大的应用潜力。王书锦等[40]从辽宁近海12个地区的128个定位点的海水和海泥中分离到上万株海洋放线菌，通过初步鉴定发现这些菌株以链霉菌属为主，占分离到海洋放线菌总数的95%，多株具有抗菌活性，其中几株对致病性弧菌等包括副溶血性弧菌有很强的抑制与杀灭效果。

1.5 其他拮抗菌

假单胞菌(Pseudomonas)是海水环境中常见的革兰阴性菌，能产生大量的次生代谢物，可抑制包括副溶血性弧菌在内的多种病原菌。Chythanya等[41]筛选出1株对哈氏弧菌、河流弧菌、副溶血性弧菌、美人鱼弧菌和创伤弧菌均有抑制作用的假单胞菌I-2，经分离鉴定，发现其抑菌物质具有热稳定性好、溶于氯仿的特性，其活性物质为一种耐受蛋白酶的小分子化合物。Vijayan等[42]从半咸水湖泊中分离到1株假单胞菌PS-102，该菌株能够抑制多种虾养殖环境中的病原性弧菌，对其温度、pH和盐度的广泛耐受研究后发现，该菌株具有对虾养殖优良益生菌的潜质。李继秋[43]从中国明对虾养殖水体中分离到1株烟草节杆菌(Arthrobaternicotianae)XE-7，该菌株对副溶血性弧菌、鳗弧菌和沙蚕弧菌都有明显拮抗作用，其抑制水体弧菌的效果与氯霉素相当，添加到饲料中能提高凡纳滨对虾的生长率和对副溶血性弧菌的抵抗力。Balczar等[15]从凡纳滨对虾肠道中分离1株玫瑰杆菌(Roseobactergallaecienciensis)SLV03，该菌对致病性副溶血性弧菌PS-017有明显的拮抗作用。张玲[44]从耐受白斑病毒的中国明对虾肠道中分离到1株嗜盐单胞菌(Halomonaas)B12，在饲料中添加7.18×1010cfu/g的嗜盐单胞菌B12可显著提高中国明对虾肠道总菌数，降低肠道中弧菌数量，提高中国明对虾幼体的成活率和对哈氏弧菌及副溶血性弧菌的抗病力，改善对虾养殖水体水质。杨世平等[45]将对虾养殖水体中分离到的沼泽生红冬孢酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)添加到凡纳滨对虾基础饲料中，可显著减少对虾肠道内弧菌数以及弧菌与总细菌的比例。

2 筛选拮抗菌的常用方法

目前，通常采用体外拮抗试验进行拮抗工业生产筛选，首先在琼脂培养基上共培养候选菌株检测是否存在拮抗效果[37,46]。常用方法如纸片扩散法[47-48]、牛津杯法[49]、平板打孔法等[50-51]。王文君[49]采用牛津杯法从对虾养殖池塘分离筛选出1株对病原菌有拮抗作用的枯草芽胞杆菌菌株，并对其进行了体外拮抗试验。韦露等[18]利用平板打孔法筛选到1株无溶血性且对多株病原菌具有拮抗作用的海洋细菌短小芽胞杆菌B1。王春迪[20]采用滤纸片法筛选到1株对携带毒力基因PirA和PirB的副溶血性弧菌具有拮抗性的假交替单胞菌。由于纸片扩散法简单方便，多采用该方法验证及筛选拮抗菌。

3 拮抗菌活性物质的种类

自1945年报道枯草芽胞杆菌可产生拮抗物质以来，研究者们已从枯草芽胞杆菌的不同菌株中分离出数十种抗菌物质，主要有抗菌肽(bacitracin)[52]和大环脂(cycleopetite)[53-54]，是由不同成分组成的蛋白性的抗菌物质[55]。细菌在生产代谢过程中有可能产生多种抑菌物质，目前研究较多的拮抗物质为细菌素、抗生素以及细菌的次生代谢产物。张立娜[56]发现1株具有抑菌效果的拮抗菌——蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)，其在生长代谢过程中分泌的胞外抑菌物质包括生物表面活性剂、肽类抗生素、细菌素、溶菌酶和其他小分子拮抗物质，根据抑菌物质种类和性质的不同，其分离和纯化的方法也有差异[57]。国内外有很多关于细菌分泌胞外抑菌活性成分的分离纯化及性质的研究报道[58-59]。

3.1 细菌素类物质

细菌素是由核糖体合成的抗菌蛋白或多肽，可抑制或杀死不同细菌系或亲缘种的细菌[60-61]。其成分主要包括蛋白质、多肽、核苷酸、生物碱类等，细菌素类物质主要作用是抑菌而非溶菌或者杀菌[62-63]。细菌素的产生受染色体基因和质粒基因双重调控，部分细菌素的产生与分泌的胞外多糖有关[38]。枯草芽胞杆菌抑菌物质主要以蛋白类为主[16]，乳酸菌也能产生作为天然生物防腐剂的细菌素衍生物，研究表明对这些细菌素进行生物工程改造可增强细菌素的抗菌活性、抗菌谱和理化性质[64-65]。1925年，Gratia[66]从类细菌抑制物质(BLIS)中分离到具有抑制其他大肠菌生长的大肠菌素，即“真正的”细菌素——大肠菌素样细菌素。郝彦利等[67]筛选到1株具有广谱抑菌活性的拮抗菌，初步鉴定其抑菌物质可能为两种新型抗菌肽，分子量分别为6.5～9.5、27.0～35.0 kDa。Xu等[58]、石广举等[68]从纳豆中筛选到1株产抗菌肽的枯草芽胞杆菌(NT-6)，在饲料中添加适量NT-6的抗菌脂肽物质不仅可以促进凡纳滨对虾的生长，还可抑制副溶血性弧菌的生长。于敏[21]发现金丽假交替单胞菌菌株JG1发酵液的石油醚层、乙酸乙酯层萃取样品及水层样品均具有抑菌活性，JG1的抑菌物质中既含有某种小分子物质如脂类、糖类、色素类(6-溴吲哚-3-乙酸)化合物，也含有大分子蛋白类物质，这两类物质协同产生抑菌活性。

3.2 抗生素及次生代谢产物

放线菌在新型活性物质的发掘研究中占据了重要地位，据不完全统计，目前临床上应用的抗生素有一半以上来源于放线菌[32-36，69]。研究人员发现，海洋放线菌次级代谢产物除具有抗菌活性外，部分放线菌菌株还具有抗肿瘤、抗病毒、抑制酶作用等非抗菌活性[33]。目前海洋放线菌产活性物质在水产养殖病害上的研究报道还较少，关于有益拮抗菌产生的拮抗物质的分析研究有待进一步深入。肖支叶[70]采用纸片法对内生真菌(Phomopsisamygdali)发酵液的抑菌活性进行了检测，发现其对3种致病细菌(溶血性葡萄球菌、副溶血性弧菌、蜡样芽胞杆菌)具有明显的抑菌作用，并发现内生真菌因其多样性、复杂性和特殊性的特点使其可以产生化学结构新颖、具有多种生物活性的次生代谢产物。王蓉等[71]运用多种层析方法从海南紫海胆肠道链霉菌HDa2中寻找抗石斑鱼病原弧菌的活性分子，获得4个雷锁辛类脂化合物，其中1，3-二羟基-5-异十五烷基苯和1，3-二羟基-5-异十六烷基苯在浓度为10 mg/mL 时具有抑菌活性，1，3-二羟基-5-异十六烷基苯的活性更强。

4 拮抗菌的抑菌机制

拮抗菌的抑菌机制较为复杂，主要是通过分泌特殊代谢产物或者改变环境条件来抑制或者杀灭其他微生物的生长。相关研究表明，拮抗物质的作用机制主要是通过致病原菌畸形、产生泡状物、破坏病原菌的细胞壁、引起细胞内含物外溢，或造成菌丝扭曲、原生质凝聚、生长点膨大、细胞壁破裂、菌丝崩溃，抑制孢子萌发等完成的[6]。

4.1 抗生作用

拮抗菌可通过抗生作用产生一类代谢产物，如抗生素、有机酸等抑制其他微生物生长发育，其产生的抗菌类代谢产物多达百种，对病原菌的生长和代谢产生抑制作用，并能引起细胞内溶。李海峰等[72]从水稻叶片表面分离到的枯草芽胞杆菌7Ze3能够产生表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturinA)和环二肽等抗菌活性物质，表现出较好的拮抗效果。Yang等[73]发现生防细菌荧光假单胞菌HC1-07通过产生氯霉素抑制病原菌，防治小麦根部病害，拮抗细菌发挥生防作用的主要机制是产生具有毒性的次生代谢物质。王文君[49]将培养液中的菌体与胞外产物分别做抑菌实验时发现枯草芽胞杆菌BL1的抑菌活性成分主要存在于其胞外产物中，分析推断菌株BL1是通过抗生作用即分泌代谢产物到胞外产生抑菌作用。

4.2 竞争作用

部分拮抗菌具有适应性强、生长和繁殖速度快等特性，可占用更多的生存空间和营养，从而抑制病原菌生长和繁殖。芽胞杆菌分泌的多种酶能降解黏液和生物膜，使芽胞杆菌及其抗生素渗透到革兰阴性菌周围的黏液层中，竞争宿主营养，从而抑制其他细菌的快速生长[5]。周海平等[27]对乳酸杆菌(Lactobacillusspp.)LH的拮抗活性研究后发现，乳酸菌可黏附或者定殖在胃肠道中，在肠道中占据生态位，对其他有害细菌在胃肠道中的生存形成干扰。另外，乳酸菌产生的有机酸，还能有效降低胃肠道的pH值，从而抑制其他耐酸性较弱的细菌在胃肠道中的存活，从而提高机体的免疫力[29]。乳酸菌在胃肠道内还可利用一些糖类发酵并产生CO2使胃肠道形成厌氧环境，对其他需氧的有害微生物具有一定的抑制作用。此外，乳酸菌还可以分泌细菌素，包括羊毛硫抗菌素、小分子的热稳定肽、大分子的热不稳定肽、复合细菌素，这些细菌素可与有害微生物的细胞膜相互作用，从而实现抑菌作用[74]。Fekaninova等[75]的研究表明乳酸菌不仅可以显著抑制水产养殖常见的病原菌生长，还能有效改善养殖水质。

4.3 寄生作用和诱导抗性

拮抗菌常以吸附生长、缠绕、侵入、消解等多种形式侵入到寄主体内获得营养籍以生存和繁殖，从而抑制病原菌。部分拮抗菌以一种机制为主，而多数拮抗菌同时依赖多种机制抑制病原菌。杨淑专等[76]用宿主双层琼脂平板法，测定海洋噬菌蛭弧菌对25株对虾病原菌和大肠埃希菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌的寄生作用，结果表明尽管不同的噬菌蛭弧菌菌株导致寄生的范围不同，但所有供试寄主细菌都能被某些蛭弧菌寄生从而形成清晰的噬斑。另外，许多拮抗菌还可通过诱导抗性，在寄主菌体内产生抗病相关酶活性，从而抑制病原菌的生长。李娜等[77]以青脆李果实为研究对象，研究了膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)和柠檬形克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)对其采后主要侵染性病害褐腐病的生物防治作用，膜醭毕赤酵母和柠檬形克勒克酵母可以诱导果实苯丙烷代谢途径，促进果实中活性酶的上升，进而导致木质素、酚类物质和类黄酮的大量积累，提高果实自身的控病能力。目前，利用诱导抗性作用的微生态制剂在水产养殖细菌性病害防治的应用还鲜见报道。

5 展 望

随着绿色可持续发展理念的深入，人们愈发关注基于拮抗作用的生物病害防治，从而实现高效、环保的疾病防治。随着对拮抗细菌和病原菌相互作用的深入研究，拮抗菌理论上应具备以下条件：①繁殖快、生命力强；②性状稳定、不易突变、适应性强；③抗菌谱广；④绿色环保；⑤适宜于商业生产和使用，适于与化学农药混合使用[6]。

目前关于拮抗菌的研究主要集中在对病原菌具有显著抑制作用的益生菌筛选研究上，而对其拮抗物质的作用机制研究报道还较少[78]。在拮抗菌相关抗病害基因和遗传作用机制的基础上，现代生物技术的应用，可显著提高拮抗菌的筛选效率及拮抗能力的研发，并可以进一步分析研究其拮抗活性物质特性，从而为药物合成提供理论支撑。此外，由于微生物发酵技术还不完善，造成拮抗菌拮抗效果不显著且不稳定，严重阻碍产业的发展，因此，对拮抗菌发酵条件的探索及改进优化是当务之急，对于促进农业可持续发展，提高经济效益、社会效益和生态效益有着广阔的发展前景。