乙脑/寨卡嵌合病毒包膜蛋白T120A位点突变对小鼠脑内神经毒力的影响

冯亚岚， 李玥珂， 任 阳， 唐丽萍， 黄 荣， 袁 磊， 杨 健*

(1.川北医学院 基础医学院，江苏 南充 637000；2.川北医学院附属医院 感染科，江苏 南充 637000)

包膜(envelope, E)蛋白是成熟黄病毒结构中唯一的糖蛋白，对病毒毒力起着重要调控作用[1]。大量文献报道E蛋白突变能够减弱黄病毒的神经毒力[2-3]。与登革病毒、乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)一样，寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)隶属于黄病毒科黄病毒属[4]。自1947年由乌干达寨卡森林发现以来[5]，ZIKV引起多次爆发流行，世界卫生组织已将其列入危害人类健康的主要病原体之一[6]。目前由于ZIKV感染仍无有效治疗方法，使得疫苗研发迫在眉睫。本课题组从事嵌合病毒疫苗的研究，前期研究发现，嵌合病毒JEV/ZIKV(MR766)具有较强的小鼠脑内神经毒力，而JEV/ZIKV(PRVABC59)对小鼠无明显脑内神经毒力，结合Li等[7]的研究，推测是MR766中E蛋白的氨基酸突变所致。通过与弱毒株氨基酸序列比对发现，E蛋白中存在多个氨基酸突变，其中T120A突变是其第一位氨基酸突变[8]，并且位于E蛋白结构域II(EDII)，该区已被证实对病毒的复制有重要意义[9]，由此推测E120很可能是影响病毒毒力的重要位点。本研究以嵌合病毒JEV/ZIKV为骨架构建其突变病毒JEV/ZIKV (T120A)，探索 E120位点突变对嵌合病毒小鼠脑内神经毒力的影响，为嵌合病毒的进一步减毒以及寨卡病毒的减毒机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株、细胞、病毒及实验动物 质粒pACNR-JEV-5′(含有乙脑疫苗株nt 1～3 450序列)、质粒pACNR-JEV-3′(含有乙脑疫苗株nt3 445～10 977序列)、pACNR-JEV/ZIKV-5′(乙脑疫苗株prM/E编码序列被寨卡病毒相应部位序列取代)由本实验室构建并保存；大肠埃希菌感受态TOP10、BHK21均为本室保存；乙脑/寨卡嵌合病毒JEV/ZIKV由本实验室拯救保存；清洁级昆明小鼠由川北医学院动物实验中心提供。

1.1.2 主要试剂 引物由上海生工合成，F2：5′-GCTTGGCAGTTGTCATAG-3′； R3：5′-AGATCTGA-

CTCCGCACACGCCTT-3′； E120F：5′-TGCCAAGTT-

1.2 方法

1.2.1 重叠延伸PCR扩增含T120A突变的prM/E片段 以质粒pACNR-JEV/ZIKV-5′为模板(含JEV/ZIKV-5′基因片段(nt 1～3 450))，用引物F2和E120R、E120F和R3分别配对扩增5′和3′片段。扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，共25循环；72 ℃ 5 min。胶回收扩增片段，各取1 μL等量混合作为模板，进行重叠延伸，扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，共10循环；加入引物F2和R3继续扩增目的片段。扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，共25循环；72 ℃ 5 min。胶回收扩增的DNA片段。PCR扩增流程见图1。

图1 重叠延伸PCR扩增含T120A突变DNA片段示意图Fig.1 Construction flow chart of T120A mutated DNA fragments by overlapping PCR

1.2.2 JEV/ZIKV (T120A)感染性克隆的构建 以含T120A突变的ZIKV prM/E片段替换pACNR-JEV-5′ (nt 1～3 450)中相应区域，在此基础上进一步连接JEV-3′ (nt 3 445～10 977)片段，得到突变病毒全长的cDNA质粒pACNR-JEV/ZIKV (T120A)(图2)。

图2 含E120 突变的JEV/ZIKV(T120A)感染性克隆的构建Fig.2 Construction flow chart of infection clone of JEV/ZIKV (T120A) virus

1.2.3 突变病毒cDNA质粒的酶切鉴定 分别用BspEI和XhoI、BamHI和HindIII双酶切，HindIII单酶切JEV/ZIKV(T120A)突变病毒全长cDNA质粒，37 ℃ 水浴2 h，用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 突变病毒的拯救及传代 用XhoI酶切处理质粒pACNR-JEV/ZIKV (T120A)，酶切完全后加入绿豆核酸酶30 ℃作用30 min，再加入终浓度0.01%的SDS灭活该酶，用PCR试剂盒回收。以线性化的JEV/ZIKV (T120A)为模板，按体外转录试剂盒操作制备RNA，加入DNA酶反应20 min后，回收纯化的RNA，电转染BHK21细胞，接种于T25培养瓶，37 ℃ 5% CO2孵箱培养5～6 d，反复冻融3次，收集上清，离心，分装，标记为P1代病毒，-80 ℃保存。取P1代病毒接种单层BHK21细胞，吸附1 h，换2%维持液，于37 ℃ 5% CO2孵箱培养，直至40%细胞出现病变，再次收集上清，分装，-80 ℃保存。

1.2.5 病毒的测序鉴定 用RNA回收试剂盒提取突变病毒基因组RNA，再按逆转录试剂盒操作，制备cDNA，运用引物F2和R3配对进行PCR扩增。扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 3 min，共30 循环；72 ℃ 10 min。胶回收扩增的PCR产物，送至大连宝生物公司测序。

1.2.6 病毒蚀斑试验 首先，接种BHK21细胞于六孔板内，待每孔细胞融合达80%时，再接种病毒37 ℃ 吸附1 h。接着用2% BSA和终浓度为10 g/L的低熔点琼脂糖覆盖各孔，37 ℃ 5% CO2恒温孵箱中放置5 d。最后，用4%甲醛固定30 min，10 g/L的结晶紫染色15 min，水冲洗，晾干后计数并比较蚀斑的大小。

1.2.7 突变病毒生长曲线绘制 按感染复数M.O.I=0.01接种突变病毒，每隔1 d收取200 μL上清液，-80 ℃冻存直至细胞全部病变。收集的上清通过蚀斑实验计算相应病毒滴度。重复上述试验2次，绘制病毒生长曲线。同时，设嵌合病毒JEV/ZIKV为对照。

1.2.8 神经毒力LD50检测 取病毒JEV/ZIKV(T120A)(6.5×105pfu/mL)、JEV/ZIKV(0.95×106pfu/mL)分别脑内注射3周龄(12～14 g)清洁级昆明小鼠，试验分5组，每组6只，每只脑内接种10倍系列稀释病毒液0.03 mL。观察14 d，记录小鼠死亡数量，Reed-Muench法计算病毒LD50，并绘制生存曲线。

2 结果与分析

2.1 重叠延伸PCR扩增含E120 突变的prM/E片段

以质粒pACNR-JEV/ZIKV-5′为模板(含JEV/ZIKV-5′基因片段nt 1～3 450)，用引物F2和120R配对扩增含E120突变的prM/E片段，扩增产物大小约为900 bp，引物120F和R3配对扩增产物约为1 300 bp，以重叠延伸产物为模板，用引物F2和R3配对扩增产物约2 200 bp(图3A)，与理论值相吻合。

2.2 pACNR-JEV/ZIKV (T120A)-5′质粒的酶切鉴定

将pACNR-JEV/ZIKV (T120A)-5′质粒分别进行AscI+KasI、KasI+BglII、BglII+BspEI双酶切，均获得与理论值大小相符的2条片段(图3B)。

2.3 pACNR-JEV/ZIKV(T120A)全长质粒的酶切鉴定

质粒pACNR-JEV/ZIKV(T120A)经BamHI单酶切，获得片段大小约13.6 kb，BspEI+XhoI双酶切，获得片段大小约7.5和6.1 kb，HindIII单酶切，获得片段大小约6.0、3.3、2.0、1.4、0.6、0.3 kb，与理论值相符(图3C)。

图3 pACNR-JEV/ZIKV(T120A)酶切鉴定Fig.3 Restriction endonuclease analysis of pACNR-JEV/ZIKV(T120A)A～C：含E120 突变的JEV/ZIKV(T120A)感染性克隆的构建及鉴定。A：含E120突变prM/E重叠延伸PCR扩增产物；B：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′酶切鉴定；C：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)全长酶切鉴定；M1：DNA 分子量标准(1.5 kb)；1：引物F2和E120R配对扩增产物(900 bp)；2：引物E120F和R3配对扩增产物(1 300 bp)；3：引物F2和R3配对扩增产物(2 200 bp)；4：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′重组质粒(6 000 bp)；5：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′AscI、KasI双酶切产物；6：pACNR-JEV(T120A)-5′ KasI、BglII双酶切产物；7：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′BglII、BspEI双酶切产物；M2：DNA 分子量标准 (2 kb)；8：pACNR-JEV/ZIKV(T120A) BamHI单酶切产物；9：pACNR-JEV/ZIKV(T120A) BspEI、XhoI双酶切产物；10：pACNR-JEV/ZIKV(T120A)重组质粒(13 600 bp)；11：pACNR-JEV/ZIKV(T120A) HindIII单酶切产物Construction and restriction endonuclease analysis of the infectious clone of JEV/ZIKV(T120A)containing full-length cDNA of mutant virus(A-C). A：Amplification products by overlapping PCR; B：Restriction endonuclease analysis of pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′; C：Restriction endonuclease analysis of pACNR-JEV/ZIKV(T120A)；M1: DNA Marker (1.5 kb); 1: Amplification products of primer F2 and E120R(900 bp); 2: Amplification products of primer E120F and R3(1 300 bp); 3: Amplification products of primer F2 and R3(2 200 bp); 4: pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′ recombinant plasmid(6 000 bp); 5: pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′ AscI and KasI double digestion products; 6: pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′ KasI and BglII double digestion products; 7: pACNR-JEV/ZIKV(T120A)-5′ BglII and BspEI double digestion products; M2: DNA Marker (2 kb); 8: pACNR-JEV/ZIKV(T120A) BamHI single digestion products; 9: pACNR-JEV/ZIKV(T120A) BspEI and XhoⅠ double digestion products; 10: pACNR-JEV/ZIKV(T120A) recombinant plasmid(13 600 bp); 11: pACNR-JEV/ZIKV(T120A) HindIII single digestion products

2.4 病毒测序鉴定

E蛋白编码序列经PCR扩增，其产物测序后与GenBank发布的ZIKV(登录号：AY632535.20)和SA14-14-2(登录号：AF315119.1)比对，除在1 368位碱基处人为引入的突变A→G外，其余各处均无碱基突变或缺失。

2.5 病毒蚀斑比较

分别取病毒JEV/ZIKV(T120A)和JEV/ZIKV感染BHK21细胞进行蚀斑试验，结果见图4A。JEV/ZIKV(T120A)的蚀斑直径与JEV/ZIKV相似(1～1.5 mm)。

2.6 病毒的生长曲线

用M.O.I=0.01感染BHK21细胞，绘制病毒增殖曲线。JEV/ZIKV (T120A)在4 d内生长较快，病毒滴度于第5天达高峰(5.59 log10pfu/mL)，随后缓慢下降；而病毒JEV/ZIKV在第6天达生长高峰，滴度为6.8 log10pfu/mL(见图4B)。在整个实验的前7 d，突变病毒JEV/ZIKV(T120A)的滴度均明显低于JEV/ZIKV。

图4 拯救病毒生长特性Fig.4 Proliferation properties of the rescued virusesA、B：细胞检测病毒的增殖特性。A：病毒蚀斑形成实验；B：拯救病毒生长曲线Cells to detect viral proliferation characteristics(A，B). A： Comparison to plaque sizes of the rescued viruses; B： Growth curves of the rescued viruses

2.7 病毒的脑内神经毒力

病毒毒力测定结果见表1。病毒JEV/ZIKV (T120A)的神经毒力LD50为1.38 PFU(0.03 mL)；JEV/ZIKV神经毒力LD50为2.21 PFU(0.03 mL)，小鼠生存曲线见图5。

图5 小鼠生存曲线Fig.5 Survival curves of the Kunming mice

表1 突变病毒对小鼠脑内神经毒力(LD50)

3 讨 论

寨卡病毒(ZIKV)感染以往多为自限性，但最近几年报道的死亡病例数逐渐增多，且病毒可通过垂直传播对胎儿造成严重影响[10]，同时传播途径也由最初的蚊媒传播扩展到血液、胎盘、性传播等方式[11]，这给疾病的预防和控制带来重大挑战。疫苗接种是预防病毒性传染病的有效途径，E蛋白是ZIKV主要的黏附蛋白，也是重要的保护性抗原，因此是病毒致病机制以及疫苗研究的重要靶点[12-13]。本课题组以JEV SA14-14-2为骨架，分别用两株寨卡病毒(非洲株MR766和亚洲株PRVABC59)的前膜(prM)/E蛋白序列替换其相应区域，构建得到两株嵌合病毒。前期研究证实，JEV/ZIKV(MR766)对小鼠有较强的脑内神经

毒力[14]，而JEV/ZIKV(PRVABC59)对小鼠、3日龄乳鼠皆无明显脑内神经毒力。Li等[7]同样以JEV SA14-14-2为骨架，用ZIKV FSS13025株的prM/E替换乙脑prM/E基因序列，得到的嵌合病毒也对乳鼠和小鼠基本无脑内神经毒力。疫苗的安全性是减毒活疫苗首要考虑的因素，三株嵌合病毒对小鼠脑内神经毒力的巨大差异促使做进一步探索。通过对比分析寨卡病毒非洲株和亚洲株序列发现，在E蛋白区存在有多个氨基酸改变[8]，但在EDII区仅有E120位点的突变，又因EDII在控制病毒蛋白的复制和稳定方面起着重要作用[9]，由此推测T120A的突变极有可能影响病毒的毒力。

本研究运用重叠延伸PCR技术扩增得到含T120A突变的ZIKV PrM/E DNA片段，采用双质粒系统获得病毒JEV/ZIKV (T120A)全长cDNA，经酶切鉴定表明突变株基因全长克隆成功构建，且通过病毒拯救获得突变病毒。恢复病毒经测序表明，除引入了T120A突变位点外，E蛋白其他区域未发现有意外突变，与先前的报道[15]相结合，证明该实验系统为实现病毒定点突变、研究寨卡毒力机制搭建了可行的技术平台。

生长曲线结果显示突变病毒峰值滴度(5.59 log10pfu/mL)低于JEV/ZIKV(6.8 log10pfu/mL)，说明突变株病毒复制能力减弱。但分析蚀斑试验结果发现，突变病毒与JEV/ZIKV有大小相似的蚀斑直径。一般情况下，蚀斑大小主要由病毒的增殖能力和病毒对抗宿主细胞干扰素应答能力来决定，即病毒增殖能力减弱，蚀斑会变小，病毒对抗干扰素能力低，也会呈现小蚀斑[16]。通过进一步探索突变病毒小鼠脑内神经毒力，发现突变体的神经毒力LD50(1.38 PFU)略小于JEV/ZIKV(2.21 PFU)，说明突变病毒神经毒力略微增强。结合病毒增殖能力、蚀斑大小以及小鼠脑内神经毒力推测，突变病毒可能具有较强的对抗干扰素的能力。因此，即使增殖能力降低，病毒仍表现出较强的小鼠脑内神经毒力，但还需实验进一步证实。最近，Carbaugh等[3]研究发现，ZIKV中E154位点发生糖基化，可使病毒在小鼠脑内的神经毒力增强，同样，Li等[17]研究发现，prM中一些位点氨基酸突变也会显著改变病毒的毒力。Xie等[2]研究发现，突变株T351V的神经侵袭力减弱。上述结果说明，无论是ZIKV还是乙脑/寨卡嵌合病毒，ZIKV的E蛋白区氨基酸位点对病毒的毒力有着较大影响，值得进一步深入研究，从而为减毒活疫苗的研发以及质量鉴定提供参考。同时，也提示在构建嵌合病毒时，减毒株保护性抗原编码序列应是首要考虑的嵌入序列。