氧化石墨烯指数富集法筛选食品中的组胺适配体

朱勤超，冯俊丽，2*，戴志远，2，汪 艺

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012）

组胺（histamine，HA）是在许多食物（例如葡萄酒、奶酪、蔬菜和鱼类等）中以各种水平存在的一种生物胺（biogenic amine，BA）。大部分由生物胺造成的食源性中毒事件都与组胺有一定联系[1]。低浓度组胺参与重要神经生理功能的调节，如机体运动、体温控制、胆固醇及胆汁酸代谢和免疫反应[2]。然而，食品和饮料中高浓度的组胺对人体具有毒性作用，会引起腹泻、恶心、呕吐、心悸、头疼、心肌缺血和急性肺水肿等症状[3]。在食品加工和储存期间，组胺通常由微生物对环境中游离的组氨酸进行脱羧反应而产生。反应中涉及的外源组氨酸脱羧酶由相关的微生物释放。这些微生物有些存在于活鱼的正常微生物菌群（主要是肠道细菌）中，然而大多数似乎来自渔船上、加工厂和运输系统的污染[4]。除了卫生条件外，食品加工方法的其它因素，如其储存温度和时间对组胺生成也有一定影响。

值得注意的是，食物中的组胺一旦形成通常不会被高温破坏[5]。食品中组胺的存在及含量非常重要，它通常作为食品变质的一个指标，也是食品生产加工、运输和储存过程中质量控制、监测的生物标志物之一[6]。

据文献报道，目前鉴定、定量组胺的分析方法有：毛细管电泳技术[7-9]、气相色谱[10-11]、薄层色谱[12]、高效液相色谱[13]、比色法和荧光法[14]等。这些方法成本高，耗时且需要复杂的设备，亟待构建一种操作简便、成本低廉、速度快、灵敏度高的组胺检测方法。

适配体是由寡核苷酸随机文库通过指数富集筛选而获得。适配体的体外选择过程涉及特异结合，分离和扩增[15-16]。适配体可以靶向多种分子结构，如金属离子、生物毒素、蛋白质、细菌和病毒等[17-19]。适配体折叠成不同的二级结构或三级结构，进而具有与抗体相当的亲和性和特异性，可识别相应目标物质[20]。此外，与抗体相比，适配体具有以下几个优点[21-23]：快速可重复的合成，简单可控的精确修饰，以满足不同分析、临床诊断和治疗。其稳定性好且可逆变性，至今未发现免疫原性，具有较长的保质期。作为抗体替代物，新出现的适配体成为检测特定靶标的理想识别元件，得到国内外科研人员的广泛研究[24]。

近年来，筛选用于分子质量较小的靶标检测的适配体方法主要包括磁珠法[25]、亲和柱层析法[26]和氧化石墨烯法[27]等。本试验中采用氧化石墨烯法作为ssDNA 筛选分离的指数富集方法，不需要改变组胺的化学结构，不需要活化组胺并将其固定于载体上，只需将氧化石墨烯加入反应体系中吸附去除未与组胺结合的游离ssDNA，从而实现对食品中组胺适配体的筛选[28]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

组胺、氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）、L-组氨酸盐酸盐、血清素、5-羟色胺，上海生工生物技术有限公司；高保真PCR 酶、50 bp DNA 标准品、琼脂糖，大连宝生物工程（Takara）有限公司；其它试剂为国产分析纯级。

1.2 随机文库构建和引物合成

建立长度为81nt 的单链DNA 随机文库：5′AGT ATA CGT ATT ACC TGC AGC（N 40）CGA TAT CTC GGA GAT CTT GC 3′，两端为固定序列，中间N40 为含40 个碱基的随机序列。随机ssDNA 文库和引物均由上海生工生物工程有限公司合成。用TE 缓冲液配成浓度2 nmol/L 贮液，于-20 ℃保存备用。

1.3 聚合酶链式反应（PCR）与琼脂糖凝胶电泳

利用PCR 将每轮筛选获得的ssDNA 作为模板进行扩增。反应体系：模板DNA 2 μL，上游引物1 μL（20 mmol/L），下游引物1 μL（20 mmol/L），2× 预混液10 μL，灭菌超纯水6 μL，总体积为20 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环25 次，最后72 ℃延伸2 min。利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR 扩增产物，凝胶成像仪拍照分析，观察电泳条带是否单一，位置是否正确。

1.4 GO-SELEX 筛选方法

参考文献[29]的方法，将氧化石墨烯加入反应体系中吸附去除未与组胺结合的游离ssDNA。本试验中，将组胺溶于超纯水，配成2 nmol/L 的溶液。配制15 mg/mL GO，超声至均匀悬浮体系，使用前充分混匀。

在第1 轮筛选时，随机ssDNA 文库使用量为20 μL，组胺溶液用量为20 μL。首轮筛选体系为600 μL，在1 × 结合缓冲液（0.85% NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）中25 ℃反应2.5 h，加入100 μL 氧化石墨烯吸附30 min，然后，13 000 r/min 离心10 min，取其上清液，重复3 次，充分去除残留氧化石墨烯。将离心获得的上清液作为PCR 扩增的模板，PCR 扩增所得ssDNA 通过纯化、酶切、纯化及变性后作为第2 轮筛选所需文库。

为提高适配体筛选的特异性，每2 轮正筛后进行1 轮反筛，即分别在第3，6，9 轮用L-组氨酸盐酸盐、血清素及5-羟色胺进行反向筛选。反筛过程与正筛基本相同，在结合反应结束后，离心收集不与反筛物结合的上清液，直接作为模板进行不对称PCR 扩增。11 轮筛选所得ssDNA 经纯化，送至上海英骏生物技术有限公司序列分析。

1.5 适配体二级结构模拟

用DNAMAN 软件对测序获得的序列进行比对，并用在线程序Mfold（http：//mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）进行二级结构预测和模拟。

1.6 适配体结合特异性分析

氧化石墨烯不仅能强吸附游离的单链DNA，而且具有极好的荧光淬灭作用，能将吸附在其表面的荧光基团猝灭[29]。将测序所得序列通过分析挑选2 种代表性序列，在其5-端进行FAM 标记，分别与组胺、L-组氨酸盐酸盐、血清素及5-羟色胺在25 ℃摇床孵育2 h，加入GO 吸附并淬灭未结合的荧光标记ssDNA。反应结束后用F-7000 荧光光谱仪，在激发波长490 nm，发射波长520 nm，光电倍增电压800 V 的条件下检测孵育液的荧光强度（F）。共重复3 次试验，以不加适配体的为空白对照组，不加靶标物并不用氧化石墨烯吸附的为阳性对照组。

1.7 适配体亲和力测定

各适配体与HA 的亲和常数测定方法是：将HA 与不同浓度的适配体（0～80 nmol/L）结合2 h，然后按照1.6 节方法计算不同浓度时的亲和力，并以适配体浓度为横坐标，亲和力为纵坐标作图。利用Origin 8.0 软件拟合每条适配体的饱和曲线，计算其解离常数Kd值。

图1 基于氧化石墨烯的组胺的SELEX 筛选原理图Fig.1 SELEX of Histamine based on Graphene Oxide（GO）

2 结果与讨论

2.1 适配体筛选流程

第1 轮、第2 轮为正筛，以富集到更多的与组胺相结合的ssDNA。当富集的ssDNA 达到一定的数量，加入L-组氨酸盐酸盐、血清素及5-羟色胺进行反筛，以增强适配体的特异性。经11 轮SELEX 筛选，测序获得15 条候选适配体序列，见表1。其中有6 个适配子的序列（HAA-1、HAA-4、HAA-7、HAA-12、HAA-13 和HAA-14）在测序结果中出现5 次以上，是高频适配子。

表1 测序得到的15 条适配体序列Table 1 15 Aptamer sequences by test

2.2 适配体一级结构分析

使用DNAMAN 软件对15 条序列进行多序列比对和同源性分析，得到相应的同源树（图2）。依据该同源树将这15 条序列分成3 个家族（表2）。从表2 可看出，同源性较高的第1 家族集中了57.7%的适配体，大部分高频出现的适配体在这个家族。这表明GO-SELEX 筛选具有很好的富集作用。

2.3 候选适配体的二级结构分析

在测序结果中适配体出现的频率越高，意味着其在富集库中的占比越较高，对组胺的亲和力也越高。从3 家族中选择高频出现的适配体HAA-1、HAA-4、HAA-7、HAA-12、HAA-13 和HAA-14。利用在线程序Mfold 对这6 条高频适配体序列的二级结构进行预测和模拟。比较每个适配体的预测二级结构的自由能，适配体序列二级结构见图3。

基于ssDNA 折叠结构的稳定性主要通过自由能衡量，自由能越小，折叠结构越稳定[23]。对这6 条适配体的自由能进行比较，HAA-4 最小自由能为-6.87 kcal/mol，明显小于其它5 条适配体的自由能，表明相比其它适配体，其二级结构更加稳定。图3 可见HAA-4 为茎环结构，表现为1 个大环和2 个小环，而茎环结构正是适配体与靶标组胺结合的基础。

图2 组胺适配体同源树Fig.2 Homology tree of aptamers against Histamine

2.4 适配体特异性分析

所挑选的高频适配子对HA 的结合特异性分析见图4。HAA-4 和HAA-7 对HA 的亲和特异性较高。后续只选HAA-4 和HAA-7 适配子进行亲和常数的测定。

表2 基于同源树的组胺适配体分类Table 2 Classification of aptamers against histamine based on the homology tree

图3 预测的组胺适配体序列二级结构Fig.3 Predicted secondary structures of Histamine aptamer sequences

图4 4 种高频适配体特异性分析Fig.4 Analysis of specificities of the four high-frequency aptamers

图5 组胺适配体的解离常数饱和曲线Fig.4 Saturation curves of dissociation constant（Kd）of Histamine aptamer

2.5 适配体亲和性分析

测定HAA-4 和HAA-7 适配子的亲和常数，其中适配子HAA-4 的亲和常数饱和曲线见图5，呈较好的拟合效果，适配子与菌体之间的亲和常数Kd=48.37 nmol/L。适配子HAA-7 的饱和曲线与图4 类似，亲和常数Kd=39.73 nmol/L。根据亲和常数越小，适配体与靶标的亲和力越大的原则，适配子HAA-7 对HA 的亲和力更大。

3 结论

本研究中，利用基于氧化石墨烯的SELEX 技术，对组胺进行11 轮的筛选，分别在第3，6，9 轮用L-组氨酸盐酸盐、血清素及5-羟色胺进行反向筛选，最终获得高度亲和性和特异性的15 条适配体序列。通过适配体二级结构、亲和性和特异性分析，最终HAA-4 和HAA-7 被确定为最佳候选适配体，有望用于食品中组胺的定性、定量分析。未来的工作是确定对组胺候选配体进行化学改性和修饰，开发基于对组胺精确识别的适配体的低成本、高灵敏的新型组胺检测方法。