解淀粉芽孢杆菌发酵的3种水豆豉的营养成分、溶栓及抗氧化活性

骆 珅，刘 宏，杨绍青，闫巧娟，吴 珊，江正强

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083 2 中国农业大学工学院 北京100083）

水豆豉是以大豆为原料，由芽孢杆菌、少量乳酸菌及酵母菌等微生物自然发酵获得的中国传统发酵豆制品[1]。水豆豉富含多种营养物质，具有潜在的降血压、降血脂、抗氧化等能力，产品豉香浓郁，风味独特，深受消费者的喜爱[2]。水豆豉与日本纳豆同是细菌型豆豉的代表，两者在原料、菌株、工艺等方面较为相似，纳豆有很强的溶栓活性，被广泛研究并作为改善血栓类疾病的功能食品而闻名世界[3-4]。纳豆及部分豆豉具有的溶栓活性主要来自于发酵过程中微生物生长代谢所产的纤溶酶类物质。常见的产纤溶酶菌株主要是枯草芽孢杆菌[5]。虽然解淀粉芽孢杆菌也具有产纤溶酶的能力，但是研究较多的是产酶条件优化及酶学特性等[5-6]，尚未见用其纯种发酵制备具有溶栓活性的水豆豉的报道。

目前，国内外关于水豆豉的研究较少，且多集中于产品辅料配比和不同工艺流程对产品性质的影响，对水豆豉的活性成分及功能的研究起步较晚[1]。尹爽等[7]研究不同工艺条件下水豆豉曲的氨基酸态氮、水分、总酸等理化指标的变化情况，并对加入的辅料用量进行优化设计。刘佳慧等[8]研究了制曲温度、装载量、制曲时间、生长因子添加量等对水豆豉曲氨基酸态氮含量的影响。冯霞等[9]通过体外抗氧化试验及动物实验发现玻璃容器发酵的水豆豉比陶瓷和塑料容器发酵的水豆豉有更好的抗氧化效果。庞庆芳等[10]发现不同微生物发酵的豆豉中细菌型豆豉的溶栓活性差异显著，其中，自然发酵水豆豉的溶栓活性较低，纯种发酵可能会提高产品的溶栓活性。

本课题组早期从豆豉样品中筛选到1 株产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118。本文用该菌株发酵大豆类原料（黄豆、黑豆、双青豆）制备3 种水豆豉，并研究其营养成分、溶栓及抗氧化活性，为进一步开发能改善心血管疾病的水豆豉功能食品提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118，中国农业大学食品科学与营养工程学院酶工程实验室筛选并保藏；黄豆、黑豆、双青豆，产自黑龙江省齐齐哈尔市；辣椒粉、姜粉、食盐，购于北京市美廉美超市学清路店。

1.1.2 试剂 凝血酶、纤维蛋白原、Gly-Leu、DPPH、ABTS、Trolox、TPTZ，美国Sigma 公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英国Oxoid 公司；芦丁，上海源叶生物科技有限公司；没食子酸，上海麦克林公司；肝素钠，北京拜尔迪公司；其它试剂无特别说明均为国产分析纯级。

1.2 设备与仪器

全温振荡培养箱（HZQ-F160），太仓市豪城实验仪器制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅（TYAIB），宁波久兴医疗器械有限公司；恒温水浴锅（DK-S24），上海精宏实验设备有限公司；紫外-可见分光光度计（TU-1800PC），北京普析通用仪器设备有限责任公司；酶标仪（Thermo Multiskan FC），美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液培养 将解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 在固体培养基上活化后，挑取1 环接入液体种子培养基（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH 7.2～7.5），在37 ℃，200 r/min 下培养10 h 左右，当菌落数在109CFU/mL 时作为种子液。

1.3.2 水豆豉的制作工艺 细菌型水豆豉的制作工艺流程如下[11]：

黄豆、双青豆、黑豆→筛选→浸泡→蒸煮→接种→前酵→后熟→拌料→后酵→成品

选用颗粒饱满、大小均匀、无虫害霉变的黄豆、双青豆、黑豆原料各100 g，加入300 mL 蒸馏水于室温下浸泡18 h，浸泡后各类湿豆质量约250 g（湿豆质量为干豆质量的2.4～2.5 倍为宜）。将浸泡结束后的豆子沥水、分装（直径25 cm 的玻璃平皿中装200 g 湿豆原料），121 ℃蒸煮灭菌20 min，冷却后接入湿豆质量5%的解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 种子液，于37 ℃培养24 h，然后置于4 ℃后熟1 d。将灭菌冷却后的调料水（含5%食盐、3%辣椒粉、3%姜粉）按湿豆质量50%的添加量加入后熟完成的豆豉中，于45 ℃后发酵1 d，获得水豆豉成品。

未发酵水豆豉除在接种时将种子液替换成等量无菌水外，其余工艺与发酵水豆豉相同。

1.3.3 样品处理及提取方法 将水豆豉成品放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥48～60 h，粉碎过20目筛获得水豆豉冻干粉样品，密封保存于-20 ℃，备用。样品待测液的制备方法如下：

水豆豉冻干粉水提液制备方法：称取5.0 g 水豆豉冻干粉样品，加入50 mL 蒸馏水，25 ℃，200 r/min 摇床浸提2 h，10 000 r/min 离心10 min，收集上清液，获得水豆豉样品水提液。水提液中折合水豆豉样品冻干粉含量为100 mg/mL。

水豆豉冻干粉醇提液制备方法：称取5.0 g 水豆豉冻干粉样品，加入15 mL 体积分数80%甲醇，以480 W 功率超声处理20 min 后，4 000 r/min 离心10 min 获得上清液。重复3 次，合并上清液并将提取液体积定容50 mL，获得水豆豉样品醇提液。醇提液中折合水豆豉冻干粉含量为100 mg/mL。

1.4 活性测定方法

1.4.1 纤溶活性的测定[12]将1.4 mL 50 mmol 硼酸缓冲液、0.4 mL 0.72%纤维蛋白原溶液混匀后于37 ℃水浴锅中预热5 min，加入0.1 mL 20 U/mL 凝血酶，混匀，在37 ℃下反应10 min 待其凝固。将水豆豉冻干粉水提液（100 mg/mL）稀释5倍，在反应体系中加入0.1 mL 水豆豉冻干粉水提液稀释液（20 mg/mL），混匀后于37 ℃下反应60 min，每隔20 min 振荡混匀1 次。反应结束时立刻加入500 μL 0.2 mol 三氯乙酸溶液（TCA）终止反应，10 000 r/min 离心10 min，取上清液在275 nm处测定吸光值。阴性对照的处理为先加终止剂TCA 溶液，后加样品稀释液。酶活的定义：在上述条件下，与对照相比，测定时所用样品稀释液的吸光值每分钟增加0.01 相当于一个酶活单位，单位为FU/mL。根据水豆豉冻干粉水提液中折合水豆豉冻干粉质量，将结果换算为FU/g。计算公式如下：

式中，X——样品溶液的纤溶酶活力，FU/mL；Ar——样品的吸光值；Ac——阴性对照的吸光值；60——反应时间60 min，以1 min 计；0.1——反应的酶液体积是0.1 mL；N——稀释倍数。

1.4.2 抗凝血活性的测定 参考刘梦洁等[13]的方法并稍作调整。纤维蛋白原、凝血酶均用凝血酶均用50 mmol pH 7.2 的Tris-HCl 缓冲液（含0.12 mmol NaCl）稀释溶解。将水豆豉冻干粉水提液（100 mg/mL）依次稀释10，20，40，80，160，320，640 倍获得不同浓度的水豆豉冻干粉水提液稀释液。在96 孔板中加入140 μL 0.1%纤维蛋白原、40 μL 不同浓度的水豆豉冻干粉水提液稀释液，置酶标仪中，在405 nm 处测定吸光值。5 min 后加入10 μL 12 U/mL 凝血酶，37 ℃反应10 min 后在405 nm 处测定吸光值。阳性对照为等量10 mg/mL肝素钠代替样品。空白对照为等量Tris-HCl 缓冲液代替样品。样品的抗凝血活性按下式计算，根据样品浓度与抗凝血活性的关系计算样品的抗凝血活性IC50值。

式中，X——某浓度样品待测液的抗凝血活性百分比，%；Ac10min——反应10 min 后空白对照的吸光度；Ac5min——预热5 min 后空白对照的吸光度；As10min——反应10 min 后样品待测液的吸光度；As5min——预热5 min 后样品待测液的吸光度。

1.4.3 多肽含量的测定 采用邻苯二甲醛法[14]测定水豆豉的多肽含量，待测液为稀释20 倍的水豆豉冻干粉水提液（5 mg/mL），用Gly-Leu 二肽作为标准品制作标准曲线，单位为mg/mL，然后根据水豆豉冻干粉质量，将结果换算为mg/g。

1.4.4 氨基酸态氮含量的测定 将部分未冻干处理的水豆豉样品搅拌均匀后放入研钵中，在10 min 内迅速研磨至无肉眼可见颗粒，装入磨口瓶中备用。用已知质量的称量瓶称取搅拌均匀的水豆豉样品5.0 g，用50 mL 80 ℃的蒸馏水分数次洗入100 mL 烧杯中，冷却后转入100 mL 容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，将洗液并入容量瓶中定容100 mL，混匀后过滤获得水豆豉待测液。按照国家标准 《食品中氨基酸态氮的测定》GB 5009.235-2016 酸度计法[15]测定水豆豉的氨基酸态氮含量，单位为g/100 g。

1.4.5 总酚含量的测定 采用福林（Folin）-酚试剂法[16]测定水豆豉的总酚含量，将水豆豉冻干粉醇提液（100 mg/mL）稀释10 倍后作待测液，以没食子酸作为标准品绘制标准曲线，单位为mg GAE/mL，根据水豆豉冻干粉质量将结果换算为mg GAE/g。

1.4.6 总异黄酮含量的测定 参考Herald 等[17]的方法测定水豆豉的总异黄酮含量，将水豆豉冻干粉醇提液（100 mg/mL）稀释10 倍后作待测液，以芦丁为标准品制作标准曲线，单位为mg RE/mL，根据水豆豉冻干粉质量将试验结果换算为mg RE/g。

1.4.7 抗氧化活性的测定 参考Dai 等[18]和Gan等[19]的方法测定水豆豉的DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、FRAP 还原能力。将水豆豉冻干粉醇提液（100 mg/mL）分别稀释适宜倍数，得到不同质量浓度的稀释液，测定并计算不同水豆豉冻干粉质量浓度下的DPPH、ABTS 清除率。

DPPH、ABTS 清除率按下式计算，以Trolox 作为标准品制作标准曲线，根据水豆豉冻干粉质量，将结果用μmol TE/g 表示。

水豆豉的FRAP 还原能力测定以FeSO4溶液制作标准曲线，换算还原力，待测液的FRAP 还原能力单位为μmol Fe2+/mL，根据待测液中折合水豆豉冻干粉质量进行换算，结果以μmol Fe2+/g表示。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵的3 种水豆豉的营养成分含量

2.1.1 3 种水豆豉的多肽及氨基酸态氮含量 3种水豆豉的多肽及氨基酸态氮含量见表1。未经过发酵制备的水豆豉中多肽含量低于20 mg/g。经解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵后，双青豆水豆豉中多肽含量最高为117.5 mg/g，其次为黄豆水豆豉（108.3 mg/g）、黑豆水豆豉（84.1 mg/g）。发酵双青豆、黄豆、黑豆水豆豉的多肽含量比未经发酵的水豆豉分别提高了12，8，5 倍。未发酵水豆豉的氨基酸态氮含量也较低（0.01%～0.04%），而发酵后的黑豆、双青豆、黄豆水豆豉的氨基酸态氮含量分别为0.39，0.36，0.33 g/100 g，比未发酵时分别提高了4，9，8 倍。

表1 3 种水豆豉的多肽及氨基酸态氮含量Table 1 The contents of polypeptide and amino nitrogen of three kinds of Shuidouchis

在发酵豆类食品的生产过程中，微生物的发酵作用可以减弱原材料中蛋白酶及胰蛋白酶抑制剂的影响，有效地提高了大豆蛋白的消化率，增加了小分子肽类及自由氨基酸含量[20]。发酵水豆豉多肽含量的提高主要得益于解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 对原料大豆的发酵作用。相关企业标准要求水豆豉产品的氨基酸态氮含量（以氮计）应大于0.25 g/100 g[21]。解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118制备的3 种发酵水豆豉氨基酸态氮含量均达到0.30 g/100 g 以上，符合标准要求。氨基酸态氮含量指以氨基酸形式存在的氮元素含量，在一定范围内可判断产品是否发酵成熟，是评价豆豉产品质量的重要理化指标之一[11]。在水豆豉的发酵过程中，氨基酸态氮含量的升高反映蛋白质水解程度的加强，含量越高说明氨基酸种类越丰富，营养价值越高，且水豆豉的口感风味越好[22]。

2.1.2 3 种水豆豉的总酚及总异黄酮含量 3 种水豆豉的总酚及总异黄酮含量见表2。未发酵水豆豉的总酚含量约为3 mg GAE/g，经解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵后3 种水豆豉的总酚含量比未发酵时增加了2 倍，发酵黑豆水豆豉的总酚含量最高，为6.8 mg GAE/g，其次为发酵双青豆水豆豉（6.7 mg GAE/g），发酵黄豆水豆豉的总酚含量最低（6.3 mg GAE/g）。未发酵黄豆、双青豆水豆豉的总异黄酮含量分别为1.2，1.1 mg RE/g，发酵后黄豆、双青豆水豆豉的总异黄酮含量比未发酵时多，分别增长到2.0，2.2 mg RE/g。而黑豆水豆豉的总异黄酮含量在发酵后变化最大，未发酵时黑豆水豆豉的总异黄酮含量为1.7 mg RE/g，发酵后总异黄酮含量增加了2.4 倍，为4.0 mg RE/g，高于发酵黄豆、双青豆水豆豉。

表2 3 种水豆豉的总酚及总异黄酮含量Table 2 The contents of total phenols and isoflavones of three kinds of Shuidouchis

Xu 等[23]测定了市场上豆豉、豆酱、纳豆、腐乳等近30 种发酵豆制品的营养物质含量，结果发现豆豉中酚类物质含量在4～12 mg GAE/g 之间，且大部分低于7 mg GAE/g，研究发现样品总酚含量的差异可能是由于原材料中营养成分、选用的发酵菌株、生产工艺（如油煎、加盐量、香料等）等不同所致。3 种大豆制作的水豆豉经发酵后总异黄酮含量均得到提高，其原因可能是在发酵过程中，微生物代谢产生的β-葡萄糖苷酶等使糖苷型异黄酮转化为苷元型异黄酮，从而使得游离型异黄酮的含量升高[24]。

2.2 解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵的3 种水豆豉的溶栓活性

未发酵水豆豉在抗凝血活性及纤溶活性方面未被检测出活性。解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵水豆豉的抗凝血活性随着水豆豉质量浓度的增加而呈上升趋势。水豆豉冻干粉质量浓度为1.3 mg/mL 时，抗凝血活性最高达98.9%。由表3 可知，3 种发酵水豆豉中发酵黑豆水豆豉具有较高的抗凝血活性，其IC50为0.27 mg/mL，优于黄豆和双青豆水豆豉（0.35 mg/mL 和0.36 mg/mL）。3 种发酵水豆豉的抗凝血活性略低于阳性对照肝素钠（IC50=0.21 mg/mL）。黑豆水豆豉经发酵后纤溶活性最高达102.5 FU/g，发酵双青豆水豆豉的纤溶活性（92.7 FU/g）高于发酵黄豆水豆豉（86.5 FU/g）。

表3 3 种水豆豉的抗凝血活性及纤溶活性Table 3 The anticoagulant and fibrinolytic activities of three kinds of fermented Shuidouchis

研究发现，纤溶酶可以直接溶解纤维蛋白，从而发挥溶栓功效[25]，而具有抗凝血活性的酚类、多糖等天然产物可以阻碍纤维蛋白原转化为纤维蛋白，在抗凝血过程的最后阶段起作用[26]，因此纤溶活性和抗凝血活性的高、低在一定程度上反映样品溶栓能力的强、弱。刘梦洁等[13]研究了枯草芽孢杆菌MJ-1 制备的黄豆纳豆的溶栓活性，纳豆提取物质量浓度在3 g/mL 时抗凝血活性达91%，纳豆激酶活性为90.2 FU/g（以干重计）。其它报道中，发酵豆制品的纤溶活性大多在20～80 U/g[27-28]。综合2 种活性测定结果可知，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵的3 种水豆豉的溶栓活性处于较高水平，且发酵黑豆水豆豉的溶栓能力最强。张敏等[29]研究发现黑豆淡豆豉的溶栓酶活力比黄豆淡豆豉高。其原因可能是：与黄豆相比，黑豆含有较多的蛋白质、钾、镁、钙、B 族维生素、可溶性膳食纤维、异黄酮等营养物质，丰富的蛋白质为微生物的生长提供了充足的氮源，而具有抑制纤溶酶产生的易代谢利用碳源的含量较低，可进一步促进纤溶酶的产生[30-31]。此外，也与发酵过程中豆类间隙大小有关，黄豆的颗粒较小，颗粒间空隙较小而密集，使得微生物在生长代谢时利用水分及氧气的效率较低，从而影响纤溶酶的产率[30]。

2.3 解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵的3 种水豆豉的抗氧化能力

2.3.1 3 种水豆豉的DPPH 自由基清除能力 解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵水豆豉的DPPH自由基清除能力由高到低为：黑豆水豆豉（15.5 μmol TE/g）、黄豆水豆豉（9.5 μmol TE/g）、双青豆水豆豉（6.8 μmol TE/g）（图1）。与未发酵时相比，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵黄豆、双青豆、黑豆水豆豉DPPH 自由基清除能力分别提高了2.5，3.3，3.9 倍。

2.3.2 3 种水豆豉的ABTS 自由基清除能力 解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵水豆豉与未发酵水豆豉的ABTS 自由基清除能力相比有显著提高（图2）。其中，清除能力最强的是黑豆水豆豉，为46.6 μmol TE/g，比未发酵时提高了2.3 倍，黄豆及双青豆水豆豉的ABTS 自由基清除能力相当，分别为41.4 μmol TE/g 和41.8 μmol TE/g，比未发酵水豆豉分别提高了2.4 和3.3 倍。

图1 3 种水豆豉的DPPH 自由基清除能力Fig.1 The DPPH radical scavenging activities of three kinds of Shuidouchis

图2 3 种水豆豉的ABTS 自由基清除能力Fig.2 The ABTS radical scavenging activities of three kinds of Shuidouchis

2.3.3 3 种水豆豉的FRAP 还原能力 水豆豉的FRAP 还原能力如图3所示。解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 的发酵过程提高了水豆豉的FRAP还原能力，黑豆、黄豆、双青豆的FRAP 还原能力分别为13.6，9.4，8.7 μmol Fe2+/g，黑豆水豆豉的还原能力强于黄豆、双青豆水豆豉。

解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵3 种原料（黄豆、双青豆、黑豆）制备的水豆豉的DPPH、ABTS 自由基清除能力和FRAP 还原能力都得到提高，黑豆水豆豉的抗氧化活性最强。比较黑豆、黄豆、双青豆水豆豉的营养成分含量发现，3 种水豆豉的多肽、氨基酸态氮和总酚含量较为相近，而黑豆水豆豉的总异黄酮含量为黄豆、双青豆水豆豉的2 倍，大豆异黄酮有较强的自由基清除能力，苷元型异黄酮在抗氧化能力方面表现出更高的生物活性，因此异黄酮含量可能是影响抗氧化活性的重要因素[24]。

图3 3 种水豆豉的FRAP 还原能力Fig.3 The FRAP radical scavenging activities of three kinds of Shuidouchis

Xu 等[23]探讨了近30 种发酵豆制品（豆豉、纳豆、腐乳、豆酱等）中活性物质生成与分布的关系，并全面测定了样品的抗氧化活性。结果表明：不同菌株、制作方法获得的发酵豆制品的抗氧化活性存在差异。中国豆豉的DPPH 清除能力为2.7～23.1 μmol TE/g，FRAP 还原能力在4 ～10 μmol Fe2+/g，纳豆的抗氧化活性为2.2～13.9 μmol TE/g，发酵黑豆产品的抗氧化活性普遍高于发酵黄豆产品。发酵过程中增加的总异黄酮、抗氧化肽等抗氧化成分，可以帮助保护身体免受自由基的攻击。Gan 等[32]研究了黄豆、黑豆、芸豆、扁豆、豇豆、腰豆及其发酵产物的抗氧化活性，发现自然发酵和副干酪乳杆菌279（Lactobacillus paracasei 279）、植物 乳 杆 菌 WCFS1（Lactobacillus plantarum WCFS1）发酵黑豆、黄豆的ABTS 清除能力分别为15.4～15.8 μmol TE/g 和5.2～6.6 μmol TE/g，自然发酵中的优势微生物与纯种发酵所用微生物同是乳酸菌，发酵过程没有显著提高原料的抗氧化活性，这说明在选用发酵剂时微生物菌株的种类对发酵产物的抗氧化能力有很大影响。

结合3 种抗氧化能力测定试验的结果可知，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 的发酵作用显著地提高了水豆豉的抗氧化活性，其发酵的水豆豉可作为一种能有效清除自由基的功能食品。

3 结论

解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118 发酵制备的黄豆、双青豆、黑豆水豆豉与未发酵水豆豉相比，明显提高了多肽、氨基酸态氮、总酚、总异黄酮等活性物质的含量，且具有较高的溶栓和抗氧化活性。其中，黑豆水豆豉在营养物质含量和功能活性方面优于黄豆、双青豆水豆豉，特别是具有最高的纤溶活性及抗凝血活性，具有开发或改善心脑血管疾病用功能食品的潜力。