周期素依赖性激酶10 在食管鳞癌中的表达及其临床意义

冶正财， 游颜杰， 呼圣娟，

（1.宁夏医科大学附属自治区人民医院暨第三临床学院，银川 750002； 2.宁夏回族自治区人民医院消化内科，银川 750002）

我国是食管鳞状上皮细胞癌（简称食管鳞癌）的高发国家之一，转移是导致食管鳞癌临床治疗失败和患者死亡的最主要原因。深入研究食管鳞癌转移相关分子机制，将为开发临床诊断的分子标志物、确定临床治疗的药物靶点以及制订有效的临床治疗方案提供理论和实验依据[1]。细胞周期素依赖性激酶10（cyclin-dependent kinase 10，CDK10）是细胞周期蛋白依赖性激酶家族成员[2-4]。研究[2-7]表明，CDK10 受到诸多信号通路的精细调控，可能在不同来源恶性肿瘤进展中发挥不同的功能与作用。本研究应用免疫组织化学法检测CDK10 蛋白在食管鳞癌组织中的表达状态，旨在探讨其与临床病理因素和患者生存期的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

食管鳞癌组织石蜡包埋标本组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司，包含2007 年7 月—2010 年12 月手术切除并经病理确诊的208 例原发食管鳞癌组织，样本来源于上海市肿瘤疾病研究所。依据国际抗癌联盟（International Union Against Cancer）TNM 分期：Ⅰ期20 例，Ⅱ期83 例，Ⅲ期70 例，Ⅵ期25 例（10 例缺失）；病理分级：Ⅰ期34 例，Ⅱ期135 例，Ⅲ期39 例。患者术前未接受任何放化疗和生物治疗。对于所有患者资料进行电话生存随访截止到2017 年7 月，其中死亡患者149 例。

1.2 主要试剂

兔抗人CDK10 多克隆抗体购自Abcam 公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记通用性EnVision试剂盒购自上海长岛生物技术有限公司，DAB 试剂购自中山金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色

石蜡包埋标本经4 μm 厚度切片，0.01 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液抗原热修复。按EnVision 二步法说明书进行染色，CDK10 抗体工作浓度为1∶200，DAB 显色，苏木素对比染色，透明封固，PBS 代替一抗作为空白对照。

1.4 结果判定

CDK10 表达状态判定标准[5]：以细胞核出现明显的黄色至棕黄色颗粒为阳性细胞信号。采用2 个参数（即染色强度和阳性细胞数）记分乘积的半定量计分方法。着色强度记分标准：无着色为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。随机选取10 个高倍视野（×400）计数肿瘤细胞的阳性百分率，记分标准：无染色为0 分，1%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，76%～100%为4 分。染色强度记分与阳性细胞数记分之积为最后得分，＜3 分为低表达，≥3分为高表达。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS 17.0 统计软件进行分析。计数资料比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier 法和Log-rank 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床病理参数的食管鳞癌组织中CDK10表达比较

食管鳞癌组织中CDK10 蛋白主要表达于肿瘤细胞的细胞核（图1）。208 例临床样本中，54例呈低表达（26.0 %），154 例呈高表达（74.0 %）。食管鳞癌组织中CDK10 表达在临床TNM 分期III/IV 期高于I/II 期，淋巴结转移组（N1～N3）高于无淋巴结转移组（N0），T3/T4 组高于T1/T2 组，男性患者组高于女性患者组（P 均＜0.05）。不同年龄、组织学分级、P53 和Ki67 表达状态下，CDK10 表达差异无统计学意义（P 均＞0.05）。见表1。

图1 食管鳞癌组织中CDK10 的表达（EnVision ×200）

2.2 CDK10 表达与食管鳞癌预后参数的关系

Kaplan-Meier 法分析食管鳞癌组织中CDK10表达与患者总生存期之间的关系。食管鳞癌组织中CDK10 高表达的患者［中位生存时间为（31.3±2.7）个月］总生存期低于CDK10 低表达的患者［中位生存时间为（69.5±63.1）个月）］（P＜0.001）。见图2。

3 讨论

选择特异性的肿瘤分子标志物，并以此建立灵敏高效的检测方法成为乳腺癌转移临床诊断、预后评估与指导合理用药的迫切要求。已有研究[6-7]表明在雌激素受体（estrogen receptor，ER）存在的情况下，CDK10 表达缺失增强乳腺癌细胞对选择性雌激素受体调节剂他莫西芬的药物抵抗性。在肝癌和胆管癌中的研究[2，8]发现，CDK10在多种恶性肿瘤组织和肿瘤细胞系中表达下调或缺失。此外，相关研究[9]证实乳腺癌中CDK10同C1orf63 二者呈正相关关系，而C1orf63 是一种参与细胞周期退出的细胞静态控制基因（cellular quiescence-controlling gene），二者表达呈现正相关。功能试验证实miR-3127-5p 可通过抑制CDK10 表达促进肝癌细胞迁移与侵袭[10]。近期在乳腺癌和卵巢癌中的研究[11-12]证实，启动子高频甲基化可能是造成CDK10 基因失活的重要原因之一。上述既往研究表明CDK10 在多种恶性肿瘤组织中表达下调或缺失，可能是新的候选抑癌基因，然而对于CDK10 基因表达在食管鳞癌中的研究目前未有相关报道。

表1 不同临床病理参数的食管鳞癌组织中CDK10 表达比较

图2 食管鳞癌组织中不同CDK10 表达患者生存曲线的比较

本研究发现食管鳞癌组织中CDK10 表达在临床TNM 分期III/IV 期高于I/II 期，淋巴结转移组（N1～N3）高于无淋巴结转移组（N0），T3/T4 组高于T1/T2 组，男性患者组高于女性患者组。据此推测CDK10 高表达可能是促进食管鳞癌发展的重要分子事件。结合患者预后资料进一步统计分析发现，CDK10 高表达患者总生存期低于低表达者。上述结果提示在食管鳞癌进展中CDK10可能发挥类似于癌基因的作用，这有别于以往在其他类型肿瘤中研究发现CDK10 所呈现的抑癌基因功能[2，4-5，7-10，13-14]。本课题组前期研究[5，13-14]中应用免疫组化对CDK10 蛋白在乳腺癌和胃癌组织中的表达状态进行了检测，发现CDK10表达缺失与淋巴结转移、临床分期和患者总生存期密切相关，CDK10 表达可作为患者预后评判的独立指标。目前，对于CDK10 在不同种类恶性肿瘤中发挥差异性作用的具体机制鲜有相关报道。这种差异性可能同CDK10 作为主导基因在细胞周期进程中受到诸多信号通路的精细控制，调节众多从属基因协调表达从而在不同组织来源的肿瘤中产生不同的功能有关。此外，不同的肿瘤微环境也可能是造成CDK10 表现差异性的原因之一。今后，扩大临床检测样本量、进行细胞与动物实验和分子机制检测是深入研究CDK10 在食管鳞癌中具体作用的方向。明确CDK10 与食管鳞癌临床病理和预后因素的关系，不仅有助于改善食管鳞癌临床诊断的准确性，而且可提供更为敏感高效的食管鳞癌预后评价指标，从而指导临床医生为患者制订更加完善的个体化治疗方案，提高食管鳞癌的整体治疗水平。