酱香型白酒大曲微生物研究进展

蒋倩儿，陈文浩，孙金沅*，刘 洋

（1.宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；2.北京工商大学中国轻工业酿酒分子工程重点实验室，北京 100048；3.北京科技大学化学与生物工程学院，北京 100083）

中国白酒是以粮谷为原料，以大曲、小曲或麸曲以及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的蒸馏酒，是世界六大蒸馏酒之一[1]。酱香型白酒作为中国白酒的传统典型酒种之一，具有酱香突出、幽雅细腻、回味悠长、空杯留香持久等特点，受到很多消费者青睐[2]。酱香型白酒酿造工艺独特，整个生产周期需经历二次投料，八轮次发酵，七次蒸酒，长期陈酿，精心勾兑而成[3]。高温大曲作为酱香型白酒的微生物载体和糖化曲剂，为白酒的酿造提供了丰富的微生物菌株、独特的酱香成分和前体物质，是形成酱香型白酒特有风味的关键因素[4-5]。高温大曲发酵在生产过程中起着重要作用，其质量直接关系到白酒的生产和质量[6]。国内对于酱香型白酒微生物的研究多集中于功能微生物的研究、香味成分分析，以及筛选获得相关功能性菌株用以提升酱香白酒的风味。

本文主要对酱香型白酒大曲微生物的多样性分析、产香成分研究、酶活研究以及大曲微生物在酱香型白酒生产中应用的最新研究进展进行了论述，并对酱香型白酒大曲微生物未来的研究与利用提出了思考与展望，对增强白酒风味、提高白酒产量具有一定的意义。

1 酱香型白酒大曲微生物多样性分析

白酒酿造是天然混合细菌固态发酵的过程，微生物贯穿整个过程。酿造微生物的群落结构和演替决定了代谢物的类型和数量，以及白酒中所含芳香物质的多样性和组成，从而形成了特定的口味和白酒类型[7]。所以高温大曲中的微生物多样性分析对于酱香型白酒大曲微生物的进一步探究有很重要的作用。

在酱香白酒大曲生产中，温度可达60 ℃以上，不同温度阶段微生物组成不同。在较低的温度下，酵母菌、霉菌和某些细菌大量积累，产生较高水平的酶和其他代谢物，酶将系统中的蛋白质水解成各种氨基酸。这些酶和氨基酸也经过美拉德和其他化学反应，产生了有助于酱香风味的化合物。在较高的温度下，只剩下耐热菌和细菌，产生大量的代谢产物，可能发生复杂的反应，产生更多的风味物质[8]。酱香型白酒微生物物种丰富，主要包括酵母菌、细菌、霉菌、乳酸菌等。

1.1 酱香大曲中的细菌

酱香型白酒中的细菌种类较多，GAN S H等[9]分析了茅台发酵剂的微生物群落组成和功能特征，揭示了茅台成熟发酵剂的优势菌群为链孢杆菌属（Desmospora）、芽孢杆菌属（Bacillus）、乳酸菌属（Lactobacillus）、海洋杆菌属（Oceanobacillus）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）和枝芽孢菌属（Virgibacillus）。WANG Y等[10]采用Illumina MiSeq高通量测序技术对三种不同类型高温大曲（白色大曲、黑色大曲和黄色大曲）的细菌多样性进行了研究，发现在30个高温大曲样品中共鉴定出7个细菌门和262个细菌属。高温大曲样品中的优势细菌属是热放线菌（Thermoactinomyces）、葡萄球菌（Staphylococcus）、慢杆菌（Lentibacillus）、芽孢杆菌（Bacillus）、克氏杆菌（Kroppenstedtia）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、链霉菌（Streptomyces）和短杆菌（Brevibacterium）。三种不同类型高温大曲的细菌群落结构差异显著。白色大曲中的生物标志物是芽孢杆菌（Bacillus），黑大曲的生物标志物是葡萄球菌（Staphylococcus），马赛菌属（Massilia）是黄色大曲中的主要细菌，每个不同类型的高温大曲细菌结构不同。正是细菌在大曲中的的动态演替，形成了最后特殊的白酒香味。

不同地区和不同生产工艺使发酵过程中微生物群落结构的演变发生差异，最终使白酒的质量不同，不同地区同一香型白酒的微生物区系存在很大差异[11]。北派酱香型白酒是中国酱香型白酒中特有的一种。不同于茅台等南方酱香型白酒，北派酱香型白酒有其独特的香味。JIANG Q等[12]基于高通量测序技术的微生物非培养方法，解析北派酱香型白酒高温大曲制曲过程中微生物多样性及其动态演替变化规律。结果表明在6个大曲样品中，主要细菌类群为乳酸菌（Lactobacillus）、魏斯氏菌（Weissella）、芽孢杆菌（Bacillus）、代尔夫特菌（Delftia）、无色杆菌（Achromobacter）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、热放线菌（Thermoactinomyces）、火山渣芽胞杆菌（Scopulibacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）和狭食单胞菌（Stenotrophomonas），并且发现在大曲生产过程中，这些微生物群落的结构和多样性呈现动态演替。沈毅等[13]以酱香型郎酒大曲为研究对象，运用高通量测序技术解析其细菌菌落结构和多样性，发现大曲中的主要优势菌群包括高温放线菌属（Thermoactinomyces）、泛菌属（Pantoea）、克罗彭施泰特氏菌属（Kroppenstedtia）和乳球菌属（Lactococcus）等。

1.2 酱香大曲中的霉菌

酱香大曲中的霉菌能产生多种活性酶，对原料中淀粉、蛋白质等的降解具有重要作用，是酱香型白酒中的酱香风味的重要来源，其复杂的菌群多样性结构和演替对白酒风味有重要影响。酱香型大曲中霉菌资源丰富，包括曲霉、青霉、毛霉等多种霉菌。传统培养方法和高通量测序技术的结合让人们对大曲中的霉菌有了更深刻的认识。孙利林等[14]采用微生物高通量测序分析技术，对酱香型白酒第四轮次酒曲进行真菌微生物多样性和优势种群结构变化分析，结果发现在酒曲中主要优势菌有曲霉属（Aspergillus）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）和嗜热真菌属（Thermomyces）。朱治宇等[15]对茅台镇酱香白酒7个主酿区酿造大曲中的霉菌进行解析，其中从大曲样品中检出68个属，明确了曲霉（Aspergillus）、丝衣霉属（Byssochlamys）、红曲霉属（Monascus）、热子囊菌属（Thermoascus）、嗜热真菌属（Thermomyces）、毛霉属（Rhizomucor）等霉菌属是酱香白酒酿造大曲中的优势霉菌。班世栋等[16]采用传统可培养技术从酱香型白酒大曲中分离得到曲霉（Aspergillus）、红曲霉属（Monascus）、毛霉属（Mucor）、青霉属（Penicillium）等19株霉菌。向玉萍等[17]利用纯培养方法对5个酱香大曲样品中的微生物进行培养，共分离筛选得到10个属的霉菌共55株，曲霉属（Aspergillussp.）、根霉菌（Rhizopussp.）、横梗霉属（Lichtheimiasp.）、根毛霉属（Rhizomucorsp.）、红曲霉属（Monascussp.）、散囊菌属（Eurotiumsp.）、拟青霉属（Paeoilomycessp.）、毛霉属（Mucorsp.）为重要功能性菌群，其中曲霉属（Aspergillussp.）为酱香大曲霉菌的主体类群组成，占霉菌总数的一半以上。

1.3 酱香大曲中的酵母菌

酵母菌是中国白酒发酵过程中最重要的微生物，它们之间的相互作用会影响白酒的品质。酵母菌在高温大曲中主要是酒化和酯化的作用，大曲中有很多类型的酵母，主要包含酿酒酵母、假丝酵母、产酯酵母等。不同类型的酵母菌发挥不同的作用，进而影响白酒的品质。罗方雯等[18]采用高通量测序技术对茅台镇酱香白酒主酿区域酵母菌群结构多样性进行分析，结果表明，主酿区域酱香大曲的优势酵母属为复膜孢酵母菌（Saccharomycopsis）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces），其中Cystofilobasidium、Gibellulopsis、Yamadazyma、Eremothecium和Aessosporon为首次从酱香大曲中检出，对研究酱香型白酒酿造中酵母菌群的变化规律及调控机制的研究有重要意义。WU Q等[19]从茅台酒大曲发酵过程中获得9种酵母菌，包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、膜璞毕赤酵母（Pichia membranifaciens）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、粘质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、汉斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）等。结合生理和功能分析显示酵母种群的多样性非常高。这些酵母种类是重要的风味贡献者，与各种醇、酸和酯的产生密切相关。了解酵母菌的特性和功能，有助于界定酵母菌在酿酒中的价值，从而使酵母在白酒生产中得到有效的应用。

综上所述，酱香型白酒大曲中含有丰富的微生物群系，大曲中的优势菌为酱香白酒提供了丰富的微生物资源，它们作为白酒酿造过程中生香和产酶的关键功能微生物，直接影响酒体风味的形成，调节重要香气的形成，对酿造高品质酱香酒有重要意义。

2 酱香型白酒大曲微生物产香分析

2.1 白酒香味成分

白酒中的香味物质成分复杂、种类较多，如醇类、酯类、酸类、醛酮类化合物等，但绝对含量不大，研究白酒中的香气成分对改善白酒酿酒技术有较大的意义。优质的酱香型白酒因具有“酱香突出，幽雅细致，酒体醇厚，回味悠长”的特点，而深得消费者的一致好评[20]。大曲中香味成分有不少出现在酒中，如四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、吡啶、糠醛等许多香味成分在大曲中都能检测到[21]。

李登勇等[22]利用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对来源于不同生产地、企业和陈曲时间的6种酱香型大曲理化参数及挥发组分进行研究，共检出113种挥发性化合物，其中50种物质在所有样品中均检出，其中三甲基吡嗪、苯乙醇、2,5-二甲基3-丁基吡嗪等11种挥发性物质含量较高。此外，还发现茅台原产酒曲中吡嗪含量较高，而其他产区生产的酱香型酒大曲的挥发性成分主要为酯类。孙利林等[23]分析鉴定两个酱香型酒厂大曲中的挥发性风味成分，共检测到43种挥发性风味物质，其中酯类物质19种、醇类物质8种、烷烃类物质7种、吡嗪类物质5种、酮类物质4种。两个酒厂共有的酯类是丁酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯，其中己酸乙酯相对含量均最高；两个酒厂大曲共有的醇类是2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、乙醇、正丙醇，其中乙醇的相对含量均最高。WANG L等[24]分析了茅台酒中含有的萜类化合物，将茅台酒香气的描述划分为花香、果香、青草香、酸性、坚果香、甜味和其他香气，共鉴定出55种化合物，其中30种为首次在茅台中检测到。

2.2 微生物产香

微生物对酱香型白酒独特风味的形成起到了很大的作用[25]。酱香型大曲发酵中产生很多种挥发性成分，其中包括酯类和醇类、吡嗪、醛、酮、酸、酚、呋喃等[20]。这些成分主要是细菌、霉菌和酵母在大曲发酵过程中代谢产生的。张小龙等[26]从5个酱香型白酒厂取酿酒用大曲，利用气相色谱-质谱（GC-MS）分析大曲的挥发性成分。结果表明，酱香型大曲中有很多挥发性成分，如醇、醛、酸、酯、吡嗪、酮、酚类等，其中棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯、亚油酸甲酯等6种高沸点酯是大曲中主要挥发性成分，这些成分由酵母代谢提供，酵母为白酒提供果香味成分，也提供重要风味成分愈创木酚类化合物。芽孢杆菌可以产生大量的吡嗪类物质和酸味物质，芽孢杆菌在发酵过程中也提供果香味成分。王小平等[27]通过常温培养法和高温培养法对酱香大曲中的产酱香风味菌株进行筛选，得到3株产酱香风味浓郁的菌株，对这3株菌进行形态观察及分子生物学鉴定，确定该3株菌均为地衣芽孢杆菌。黄晓宁等[28]研究发现，强化添加地衣芽孢杆菌也可以显著提高大曲中四甲基吡嗪的含量，四甲基吡嗪是白酒酿造的特征气味，还是白酒的健康因子，并具有抗氧化性能；同时芽孢杆菌会影响发酵过程中微生物间相互作用，从而使得多种挥发性物质含量有所改变。邓剑清[29]选育出4株水解酶活力高和酱香浓郁的芽孢杆菌，将其作为强化功能菌用于强化高温大曲的生产，发现酱香型白酒强化高温大曲中的香气成分吡嗪类物质、苯甲醛、苯乙醇等明显升高，有利于酱香型白酒的品质提高。ZHANG R等[30]采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对地衣芽孢杆菌产挥发性物质进行了鉴定，主要成分为C4化合物、吡嗪类化合物、挥发性酸类化合物、芳香类化合物和酚类化合物，还发现接种了芽孢杆菌发酵剂的样品挥发性化合物比未接种地衣芽孢杆菌显著增加，添加芽孢杆菌发酵剂的蒸馏酒感官评价效果也有所改善。这些结果表明，芽孢杆菌是影响茅台酒香气特征的主要微生物之一。

3 酱香型大曲微生物产酶特性研究

3.1 酱香型白酒大曲酶系

在大曲的发酵过程中，微生物的生理和生化代谢会产生许多酶，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶、液化酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等，进而形成独特的酶系，这些酶可以将原料中的大分子物质分解为小分子，供微生物生长和利用以及进行发酵和代谢[31]。纤维素酶可催化β-1,4-糖苷键水解，可将纤维素降解为纤维二糖和葡萄糖。而蛋白酶能水解大曲中的蛋白质，为微生物生长提供营养物质，另一方面形成的氨基酸与葡萄糖发生美拉德反应，为白酒香味提供前体物质。脂肪酶能水解长链脂肪酸甘油生成游离脂肪酸和甘油，生成的产物构成了白酒中香味物质的本身或者前体物质[32]。

3.2 细菌产酶

芽孢杆菌是茅台酒的主要增香细菌，它具有很强的分泌降解酶的能力，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和糖化酶，并能水解蛋白质和淀粉等大分子物质，产生各种芳香物质[33]。芽孢杆菌还能产生耐热酶，可以降解细胞壁和其他多糖，可能与风味物质和前体如吡嗪有关，这些酶和芳香前体的产生也有利于大曲及其衍生物的生成[34]。地衣芽孢杆菌可产生70多种代谢产物，可通过固态发酵产生芳香族化合物、C4化合物、吡嗪和有机酸等，它在蛋白酶、脂肪酶、耐热α-淀粉酶、纤维素酶等方面具有很强的酶促活性[35]。聂慧芳等[36]研究发现，在酱香型大曲中分离出的两株枯草芽孢杆菌具有较高的蛋白分解能力。解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌是产生风味的菌株，它们能分泌α-淀粉酶快速发酵原料中的糖，完全分解成醇、酯和各种有机酸[37]。周晓龙[38]从酱香高温大曲中筛选出一株具有高产四甲基吡嗪功能的芽孢杆菌，基于分子生物学技术和生理生化试验，鉴定出这株菌株为解淀粉芽孢杆菌，通过进一步的产酶鉴定，该菌株同时能产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶、果胶酶等，其酶活性较高，且产酶种类丰富。放线菌可以产生淀粉酶、纤维素酶等酶类，有助于提高对原料的利用率和白酒的产量。在郎酒高温大曲的制作中，高温放线菌属（Thermoactinomyces）发挥重要作用，研究发现，优势菌种包括普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）和甘蔗高温放线菌（Thermoactinomyces sacchari），这两种菌具有产淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等能力，还可以生成具有酱味的吡嗪类物质和土霉味的二甲萘烷醇等挥发性产物[39-40]。

3.3 真菌产酶

霉菌能产多种酶，且霉菌产各种酶酶活差异较大。WANG B等[41]通过宏蛋白质组学分析鉴定了白酒发酵过程中的51种碳水化合物水解酶。通过溯源分析发现白酒发酵过程中约80%的碳水化合物水解酶是由酒曲提供的，其中来自曲霉、根霉和毛霉的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶与淀粉水解和乙醇产量呈正相关。说明它们是白酒发酵过程中与酒精发酵相关的关键糖化酶。印丽等[42]分析茅台白酒5个酒厂的酿造大曲，发现在酱香型白酒5种大曲中都能检测到多种水解酶酶活，但各种酶活差异较大，可能与大曲中的霉菌种类有关。此外，分析从大曲中分离到的霉菌产酶活性，发现霉菌产糖化酶酶活和中性蛋白酶酶活差异较大。曲霉主要产糖化酶、蛋白酶、果胶酶等，毛霉主要产糖化酶和蛋白酶，根霉主要产糖化酶，青霉主要产脂肪酶和果胶酶，说明霉菌对大曲中酶系的形成有重要作用。

酵母菌在大曲酒发酵过程中发挥着两个重要作用即酒化与酯化，酵母菌能产生酶来影响大曲的风味物质[43]。如扣囊复膜孢酵母能够分泌淀粉酶、酸性蛋白酶及β-葡萄糖苷酶，其产生的水解酶可以分解大曲中的大分子物质，为酿酒酵母等其他参与酿酒的微生物提供营养[44]。

此外，在酱香型白酒酿造过程中，高温大曲质量的差异会影响白酒的酒质和口感，筛选优质的高温大曲的主要标志是蛋白水解酶的活性，一定条件下，蛋白酶的酶解反应和还原糖作用生成高含量、多种类的化合物，保证曲香浓郁、优雅纯正[45]。

4 酿酒微生物在酱香型白酒生产中的应用

中国的经济处于高质量发展阶段，消费者对白酒品质的要求越来越高。研究表明，微生物的种类及数量对酱香型白酒的风味及质量有非常重要的贡献。微生物对酱香型白酒生产中意义重大，其作用主要体现在以下几方面：为制酒创造风味物质和菌源；为制酒提供各种酶类和呈香所需前体物质；为制酒提供原料。因此，可以说在酱香型白酒生产中微生物扮演着重要角色，是影响白酒品质的主要因素。刘宇等[46]在酒曲中添加3株细菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌）和2株霉菌（宛氏拟青霉、米曲霉）来强化酱香大曲，并将强化大曲应用于酱香酒的生产中。结果表明，添加适宜的功能微生物有助于提升酱香型白酒的质量。

强化大曲的酱香香气较浓郁，酱香型白酒的酱香、空杯留香、细腻度和典型性等感官指标都得到了明显改善，具有良好的应用前景。王西等[33]从高温大曲中分离得到枯草芽孢杆菌，扩大培养后干燥成菌粉，模拟实验应用于酱香酒的生产中。结果表明，发现接种枯草芽孢杆菌后四甲基吡嗪含量较高，同时发现在堆积之前加入枯草芽孢杆菌的作用效果明显优于入池发酵前加入，表明接种芽孢杆菌有利于提升白酒口感与品质。卢君等[47]优选出酿酒酵母和粟酒裂殖酵母作为强化菌株，应用于生产的发酵实验。结果显示，在强化了耐酸酵母菌剂之后，而基酒产量有明显的提高，提高比率在13.47%～25.97%之间，基酒质量除口感略偏甜外，其他风味指标没有明显差异。

5 前景与展望

随着人们消费能力、消费水平的不断提升，白酒市场仍然存在稳定增长的市场空间，酱香型白酒发展面临重要机遇和良好条件。近年来，随着科学技术的发展与大量先进分析检测技术的应用，虽然取得了较好的研究进展，但是针对包括高糖化力菌株、高液化力菌株、高酯化力菌株、高产蛋白酶菌株以及特殊产香菌等在内的酱香型白酒大曲功能菌的挖掘与功能机制研究仍然是一项“永恒的课题”。目前，对于酱香大曲中微生物和白酒发酵酶系呈系统化深入认识比较少，后续有待于系统化揭秘白酒固态发酵机理。此外，保证白酒发酵过程中菌系、酶系及物系的相互作用，用于提高和突出白酒酒体质量和风味是广大白酒科研工作者们共同努力的目标。除此之外，更值得一提的是，传统发酵用微生物菌种，特别是白酒酿造微生物菌种的安全性已经成为传统发酵食品安全关注的“核心问题”之一，基因安全性评价目前已纳入微生物安全性评价的技术体系，但是国内外目前在白酒微生物基因安全性评价领域还存在着许多空白，相关技术体系与标准有待研究与建立。