PD-L1、CD8在Ⅱ/Ⅲ期微卫星高度不稳定性结直肠癌中的表达及临床意义*

黄 艳，许天文，戴炀斌，林建光，周 爽

福建医科大学附属第二医院肿瘤内科，泉州 362000

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，发病率在全球男性中居第3位，女性中居第2位[1]。结直肠癌的主要治疗策略包括手术切除、化疗及放疗和靶向治疗，但许多患者因晚期才检测出肿瘤而错过最佳治疗时机，研究证实[2],Ⅳ期结直肠癌患者的5年生存率不及5%，且传统的化疗药物疗效不佳、毒副作用较多，因此探究新型治疗方法成为目前结直肠癌的研究方向。

程序性死亡因子配体1(PD-L1)蛋白是细胞膜上一种重要的跨膜型免疫球蛋白，其在肿瘤微环境的形成和肿瘤免疫逃逸中起着关键作用，阻断PD-1/PD-L1通路可解除对淋巴细胞的抑制作用，从而发挥治疗效果。因此PD-L1在多种恶性肿瘤免疫逃逸中发挥重要的调节作用[3]。CD8+T细胞是肿瘤微环境中起着重要作用的成分。目前有研究表明[4]，肿瘤细胞表达PD-L1及增加肿瘤浸润T淋巴细胞(tumour infiltrating lymphocytes，TILs)密度可能是抗PD-1/PD-L1免疫治疗有效的预测因素。PD-L1、CD8+T细胞和微卫星高度不稳定性(microsatellite high instability，MSI-H)结直肠癌的关系尚不明确。因此明确肿瘤组织CD8及PD-L1表达既有助于了解肿瘤微环境的免疫状况、评估预后，也可作为生物标记物筛选适宜的患者行免疫治疗。本研究采用多重荧光PCR结合毛细管电泳方法检测微卫星状态，并应用免疫组织化学技术检测PD-L1、CD8蛋白的表达，探究Ⅱ/Ⅲ期MSI-H CRC与PD-L1、CD8蛋白的表达、临床意义的相互关系，并分析Ⅱ/Ⅲ期MSI-H CRC的复发因素。

1 材料与方法

1.1 实验材料

收集2016年3月至2017年11月在福建医科大学附属第二医院住院并手术治疗的Ⅱ/Ⅲ期结直肠患者切除的癌组织及相应癌旁组织(距离癌组织边缘5 cm以上)、血液样本各61份。所有患者术前未接受放射、化疗、靶向、免疫等抗肿瘤治疗。主要实验材料包括：DNA提取试剂盒E.Z.N.A.FFPE DNA Kit(美国OMEGA公司)、DNA提取试剂盒E.Z.N.A.Blood DNA Kit(美国OMEGA公司)、去离子水(美国Applied Biosystems公司)、变性剂Hi-Di(美国Applied Biosystems公司)、Microread MSI检测试剂盒(北京阅微基因技术有限公司)、兔抗人PD-L1单克隆抗体(美国Abcam公司)、兔抗人CD8单克隆抗体(美国Abcam公司)、Streptavidin-HRP兔/鼠通用型试剂盒(北京康为世纪有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 多重荧光PCR结合毛细管电泳 分别用DNA提取试剂盒提取癌组织石蜡标本及血液标本中的DNA。分析DNA的完整性、浓度和纯度，并进行多重荧光PCR结合毛细管电泳检测。PCR条件为：95℃变性5 min；94℃变性30 s、60℃复性1 min、70℃延伸1 min，共循环30次；60℃延伸30 min。扩增产物加入配制混有ROX500分子量内标和甲酰胺的上样混合液中，在ABI 3500Dx上进行DNA测序分析，以Control DNA作为内参照，数据由GenScan 3.1软件自动收集后进行分析。

1.2.2 免疫组织化学染色 在浓度为10%的甲醛溶液中固定组织标本，采用石蜡进行包埋，之后对其连续切片至厚4 μm。石蜡切片常规脱蜡，微波热修复，30%过氧化氢溶液室温孵育15 min，磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)冲洗3次，每次3 min。滴加1∶200稀释的一抗，4℃过夜。PBS(pH 7.4)冲洗3次，每次5 min。滴加二抗1滴，37℃孵育20 min。PBS振洗2 min，重复3次。二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察。

1.3 结果判定标准

1.3.1 MSI结果 判定MSI检测是扩增正常组织和肿瘤组织DNA，将等位基因谱进行比较分析的一种检测方法。若肿瘤样本DNA的等位基因出现异常分型，表明存在微卫星不稳定。本检测试剂盒检测6个单核苷酸重复位点，有2个位点不稳定的样本即可定性为MSI-H型，只有1个位点不稳定的样本为MSI-L型，没有出现不稳定的样本为MSS型。2个五核苷酸重复位点用于检测潜在的样本混杂或污染，在MSI的分级中没有意义。如果血液标本DNA的等位基因出现异常分型，表明存在胚系突变。

1.3.2 PD-L1和CD8免疫组化结果 判定癌细胞及癌间质内PD-L1蛋白表达采用半定量积分法，结合染色强度和阳性细胞百分比来评定阳性表达病例。染色强度分级如下：棕褐色记3分，棕黄色记2分，淡黄色记1分，无着色记0分；阳性细胞密度分级为：阳性细胞数<10%记1分，10%～50%记2分，>50%记3分。两项相乘，≥3分即为阳性。肿瘤细胞和间质无论哪一项为阳性均定义为阳性表达。CD8蛋白判定标准，以胞膜或胞质内出现棕黄色染色为阳性细胞，计数阳性细胞，通过计数胞膜上有CD8阳性染色的淋巴细胞个数表示CD8+TILs的浸润情况。先在低倍镜下观察整张切片，分别在癌巢及间质区选取CD8阳性细胞丰富的3个高倍视野(×400)计数阳性细胞，并求平均值。以癌巢内CD8+TILs的均数作为临界(cut-off)值，均数以下为CD8+TILs低密度组，≥均数为CD8+TILs高密度组。

1.4 统计学方法

应用SPSS 21.0统计学软件分析。MSI结果及免疫组织化学染色结果由连续变量转化为分类变量，采用χ2检验；复发率计算应用Kaplan-Meier生存曲线法，Log-rank检验用于生存率的组间比较，采用COX比例风险模型进行多因素预后分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌微卫星状态

61例结直肠癌癌组织标本中检出MSI-H 25例(其中胚系突变8例)、MSI-L 6例、MSS 30例。本研究中结直肠癌患者MSI-H 25例，将其归为实验组；MSI-L及MSS共36例(MSI-L 6例，MSS 30例)归为对照组。

2.2 结直肠癌微卫星状态与临床病理特征的关系

研究显示实验组和对照组的性别、年龄、淋巴分期、脉管癌栓无明显差异(均P>0.05)，而肿瘤发生部位、组织类型、分化程度存在明显差异(均P<0.05)(表1)。

表1 MSI-H CRC与MSI-L/MSS CRC患者临床资料对比(例)Table 1 Comparison of clinical data between MSI-H colorectal cancer and MSI-L/MSS colorectal cancer patients(n)

组别淋巴分期N0N1～N2脉管癌栓无有分化程度高-中分化低分化对照组231313232610实验组111413121114P值0.12400.21720.0265

2.3 结直肠癌癌组织中PD-L1及CD8表达

PD-L1蛋白表达主要定位于结直肠癌癌细胞的胞质和胞膜。在癌组织中，实验组的PD-L1蛋白表达阳性率为52.0%(13/25)，对照组的阳性率为16.7%(6/36)，实验组的PD-L1阳性表达率高于对照组(P<0.05)；PD-L1在实验组及对照组的癌旁肠黏膜组织中无阳性表达。实验组与对照组癌组织的PD-L1阳性表达率均明显高于正常组织(均P<0.05)。在PD-L1高表达病例中癌细胞往往呈弥散性表达PD-L1(图1)。

图1 结直肠癌癌组织PD-L1表达的免疫组化染色情况(IHC，×200)Fig.1 Immunohistochemistry expression of PD-L1 in colorectal cancer(IHC staining，×200)

CD8蛋白表达主要定位于TILs的胞质及胞膜。在癌组织中，实验组CD8蛋白表达阳性率为64.0%(16/25)，对照组CD8蛋白表达阳性率为44.4%(16/36)，差异无统计学意义(P>0.05)；癌旁肠黏膜组织中，实验组CD8蛋白表达阳性率为52.0%(13/25)，对照组CD8蛋白表达阳性率为30.6%(11/36)，实验组及对照组CD8蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。在CD8高表达病例中局限高表达于肿瘤侵袭区域(图2)。

图2 结直肠癌癌组织中CD8表达的免疫组化染色情况(IHC,×200)Fig.2 Immunohistochemistry expression of CD8 in colorectal cancer(IHC staining，×200)

2.4 MSI-H CRC癌组织中PD-L1及CD8表达与临床病理特征的关系

分析临床病理特征与PD-L1关系的结果显示,在癌组织中PD-L1的阳性表达与MSI-H CRC患者的性别、年龄、肿瘤部位、组织类型、淋巴分期均无相关性(均P>0.05)，而与肿瘤分化程度、临床分期、脉管癌栓均有相关性(均P<0.05)。分析临床病理特征与CD8关系的结果显示在癌间质中CD8的阳性表达与MSI-H CRC患者的性别、年龄、肿瘤部位、组织类型均无相关性(均P>0.05)，而与肿瘤分化程度、淋巴分期、临床分期、脉管癌栓等差异均有相关性(均P<0.05)(表2)。

表2 MSI-H CRC中PD-L1、CD8的表达与临床病理特征的关系Table 2 Relationship between the expression of PD-L1 and CD8 and clinicopathological characteristics of patients with MSI-H colorectal cancer

2.5 基于MSI-H CRC患者PD-L1和CD8表达水平的生存分析

对MSI-H CRC患者的复发进展研究显示PD-L1+/CD8+的患者例数为12例，PD-L1+/CD8-为1例，PD-L1-/CD8+为4例，PD-L1-/CD8-为8例；PD-L1+/CD8+平均无病生存期(DFS)为(10.2±0.5)个月，PD-L1+/CD8-平均DFS为(9.0±0.1)个月，PD-L1-/CD8+平均DFS为(15.1±1.6)个月，PD-L1-/CD8-平均DFS为(14.7±1.1)个月。提示PD-L1+/CD8+、PD-L1+/CD8-患者DFS较短(均P<0.05)(图3)。

2.6 MSI-H CRC患者复发进展的影响因素分析

2.6.1 MSI-H CRC患者复发进展情况的单因素分析 结果显示分化程度、脉管癌栓、PD-L1、PD-L1+/CD8+是影响MSI-H CRC的复发进展因素(均P<0.05)，而性别、年龄、肿瘤部位、组织类型、肿瘤浸润深度、淋巴分期、临床分期、肿瘤直径、CD8不是影响该疾病的危险因素(均P>0.05)。因此高分化、无脉管癌栓、PD-L1阴性、PD-L1-/CD8-的患者其DFS较长。

2.6.2 MSI-H CRC患者复发进展情况的多因素分析 纳入COX回归的因素包括分化程度、淋巴分期、临床分期、脉管癌栓、PD-L1、CD8、PD-L1+与CD8+表达情况，研究显示PD-L1、PD-L1+/CD8+是影响MSI-H CRC复发进展的独立危险因素(均P<0.05)。

图3 不同PD-L1和CD8表达水平MSI-H患者的生存分析Fig.3 Survival analysis of MSI-H CRC patients with different PD-L1 and CD8 expression levels

3 讨论

微卫星(microsatellite，MS)序列是由1～6个核苷酸组成重复单位的DNA序列，广泛分布于染色体基因组。微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)可导致癌基因的激活或抑癌基因的失活、体细胞突变频率增加10～15倍[5]，使体细胞癌变的发生率大大提高，产生肿瘤组织。本实验通过对61例结直肠癌病理标本及血液标本行多重荧光PCR结合毛细管电泳并分析结果发现，检出MSI-H及胚系突变患者25例，发生率为41.0%；检出MSI-L患者6例，发生率为9.8%；检出MSS患者30例，发生率为49.2%。本研究结果高于以西方人群为对象的研究报道，其MSI-L/MSS检出率为27%，MSI-H检出率为20%[6]。因MSI检测要求选择肿瘤细胞大于70%以上区域提取肿瘤组织DNA，同时考虑本研究实验条件、仪器误差、判读误差等原因，且检测结果的差异还可能与研究对象的种族差异、使用的试剂盒、检测仪器不同等因素有关。本研究检出的25例MSI-H患者中，Bat-25基因突变占100%、Bat-26基因突变占96%，显示这2个单核苷酸位点在MSI-H表型检出中具有很高的敏感性。目前国内外关于结直肠癌中微卫星不稳定性的研究存在争议，有待进一步研究明确。

本研究发现MSI-H CRC中多见于结肠癌(19/25)、黏液腺癌(9/25)、低分化癌(14/25)。Huang等[7]研究发现，MSI-H CRC患者常在年轻时发病，其病理多示低分化腺癌及黏液腺癌，但少见淋巴结转移及局部浸润；同时，Birgisson等[8]研究指出，MSI-H CRC发病部位常显示为右半结肠，其病理结果常显示低分化癌，以上研究证明了MSI-H在结直肠癌的发生发展中起着关键作用，本研究结果与之一致。

本研究中MSI-H CRC的PD-L1蛋白表达阳性率为52.0%，MSI-L/MSS CRC的阳性率为16.7%，两者差异显著(P<0.05)。Rosenbaum等[9]对结直肠癌的研究发现，微卫星高度不稳定性与PD-L1引起的免疫抑制反应相关，与本研究结果所示MSI-H CRC高表达PD-L1相一致。Droeser等[10]研究显示，PD-L1在MSS的CRC中表达率为37%，本研究MSI-L/MSS中PD-L1阳性率较低，造成这种差异的原因可能是入组病例数量过少。

本研究结果显示MSI-H CRC的CD8蛋白表达阳性率为64.0%，MSI-L/MSS CRC的阳性率为55.6%，两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。正常肠黏膜组织CD8阳性率为39.3%(24/61)，与MSI-H CRC及MSI-L/MSS CRC的差异无统计学意义。有研究提示[11]MSI往往还与患者肿瘤组织内高密度的TILs存在相关性。

本研究结果显示在癌组织中PD-L1的阳性表达与肿瘤分化程度、脉管癌栓等存在明显相关性(P<0.05)。PD-L1在低分化和有脉管癌栓的MSI-H CRC中阳性率较高。同时，发现在癌组织中CD8的阳性表达与肿瘤分化程度、淋巴分期、脉管癌栓等存在明显相关性(均P<0.05)。CD8在低分化、N1～N2期、有脉管癌栓的MSI-H CRC中阳性率较高。研究证实[12]PD-L1表达与结直肠癌肿瘤分期、肿瘤分化、有无淋巴结转移和5年生存率相关，PD-L1高表达的患者预后不好，5年生存率较低。

本研究示PD-L1+/CD8+平均DFS为(10.2±0.5)个月，PD-L1+/CD8-平均DFS为(9.0±0.1)个月，PD-L1-/CD8+平均DFS为(15.1±1.6)个月，PD-L1-/CD8-平均DFS为(14.7±1.1)个月。提示PD-L1+/CD8+、PD-L1+/CD8-患者DFS较短(均P<0.05)。本研究中CD8+T细胞未能提示预后不良。然而有研究证明[13]癌巢内T细胞是DFS及总生存(OS)独立预后因素，CD8+TILs高密度者较低密度者OS显著延长(55月vs. 26月)。上述结论与本实验存在差异，其原因可能是样本量较小或判读方法存在误差。

本研究在单因素分析中发现肿瘤分化程度、脉管癌栓、PD-L1、PD-L1+/CD8+是MSI-H CRC患者的复发因素(均P<0.05)。以Ⅱ/Ⅲ期MSI-H CRC为研究对象，结果证实PD-L1是MSI-H CRC无病生存独立的复发因素，PD-L1阴性可以显著延长具有MSI-H特征结直肠癌的DFS(HR=0.005，95%CI：0.000～0.118，P=0.0012)，即发现PD-L1阴性的Ⅱ/Ⅲ期MSI-H CRC复发率显著长于PD-L1阳性的MSI-H CRC。Gadiot等[14]研究发现PD-L1的表达可作为恶性肿瘤患者预后的重要指标，与本研究结果一致。

同时，本研究还进行了MSI-L/MSS CRC患者的复发因素分析，在单因素分析中显示分化程度、肿瘤直径、PD-L1+及CD8+是影响MSI-L/MSS CRC患者的复发因素(均P<0.05)，而性别、年龄、肿瘤部位、组织类型、肿瘤浸润深度、淋巴分期、临床分期、脉管癌栓、CD8、PD-L1不是影响该疾病的危险因素(均P>0.05)。以Ⅱ/Ⅲ期MSI-L/MSS CRC为研究对象结果证实分化程度是MSI-L/MSS CRC无病生存独立的复发因素，高/中分化可以显著延长具有MSI-L/MSS特征结直肠癌的DFS(HR=0.050，95%CI：0.011～0.239，P=0.0002)。本研究中的PD-L1、PD-L1+及CD8+的表达与结直肠癌患者复发率的关系总体是一致的。但对于PD-L1、CD8的阳性判读上各研究均有所不同，可导致统计结果的差异，数据统计也存在一定的不足。

本研究结果表明，PD-L1和CD8可能参与MSI-H结直肠癌的组织分化与转移，同时检测MSI-H结直肠癌组织中PD-L1和CD8表达水平，有助于判断MSI-H结直肠癌组织分化程度、转移潜能及评估MSI-H结直肠癌患者预后。

综上所述，结直肠癌微卫星状态及肿瘤微环境的免疫分型与结直肠癌的发生发展相关，更高效地检测出MSI-H CRC患者的PD-L1和CD8的表达情况，可以对合适的患者尽早实施抗PD-1/PD-L1免疫治疗。因此重视结直肠癌微卫星状态及肿瘤微环境的免疫分型有助于评估患者预后及募集合适患者实施抗PD-1/PD-L1免疫治疗。近年来免疫治疗日益成为恶性肿瘤的重要治疗手段，期待有更深入的基础研究和大规模临床试验探索抗PD-1/PD-L1免疫治疗在结直肠癌综合治疗中的价值。