重组G5P蛋白的原核表达纯化及与PrPSc结合能力的鉴定*

朱 峰，谭家亮，吴 江，杨 茹，毕 昊，夏剑波

1华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管内科，武汉 430022 2广东三九脑科医院神经外科，广州 510510 3湖北省阳新县妇幼保健院检验科，阳新 435200 4武汉血液中心输血研究所，武汉 430030 5华中科技大学同济医学院附属湖北省妇幼保健院检验科，武汉 430070

朊病毒病(Prion disease)是由朊病毒感染引起的神经退行性疾病。朊病毒是正常的朊蛋白(PrPC)发生构象变化后形成具有部分蛋白酶K(proteinase K，PK)抗性的异常朊蛋白(PrPSc)粒子，主要侵袭人类和动物的中枢神经系统，致死率为100%。在动物中，最常见的朊病毒病包括羊的瘙痒病(scrapie)、牛的海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy，BSE)和鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease，CWD)。人类朊病毒病包括克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、致死性家族性失眠(fatal familial insomnia，FFI)、库鲁病(Kuru disease)和gerstmann-strausler-scheinker综合征(GSS)[1]。人类朊病毒病可以分为散发性、家族性及获得性。食用朊病毒感染的牛肉可获得变异型CJD(variant CJD，vCJD)。vCJD已证实可通过输血在人群间传播[2]。朊病毒病可以跨物种传播，并可在人群间传播，因此对全球公共卫生安全造成很大危害，朊病毒病的诊断对保障公共卫生安全具有重要的意义。

根据“唯蛋白质”假说，朊病毒曾被认为是不含核酸的感染性病原体，有别于细菌、病毒和真菌等。所有形式的朊病毒疾病都有一个共同的致病机制，即宿主编码的正常PrPC转化为致病性PrPSc。PrPSc具有不溶性、致病性和传染性的特点。构象变化后形成的β-折叠结构被认为是赋予PrPSc抗蛋白酶特性的原因，并导致各种构象的PrPSc的形成，它们统称为朊病毒株。迄今为止，许多针对朊蛋白的抗体已被研制以用于诊断，然而，它们大多数缺乏对PrPSc识别的特异性，不能区分PrPC和PrPSc，限制了其应用，因此有待研发能特异性结合PrPSc的分子，以提升PrPSc的检测水平[3]。值得注意的是，在研究核酸对朊病毒构象转换作用时，偶然发现来源于Ff丝状噬菌体的基因5蛋白(G5P)，能特异性地结合PrPSc[4]，显示出G5P在朊病毒病的研究与诊断方面的应用潜力。野生型G5P广泛存在于细菌中，但含量较低且不易收集。本研究利用基因克隆技术表达纯化重组G5P，并分析其检测PrPSc的能力，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.1.1 菌株与质粒E.coliDH5α菌株、E.coliBL21(DE3)菌株购于北京天根生化科技有限公司。质粒pET-28a-c(+)由协和医院心血管内科实验室保存。

1.1.2 脑组织 非CJD人脑组织块通过在湖北省阳新县妇幼保健院行流产的死胎婴儿获得。散发性克雅氏病(sporadic Creutzfeldt-Jakob disease，sCJD)患者脑组织块由广东三九脑科医院神经外科馈赠。非CJD及sCJD人脑组织块冷冻储存于-80℃冰箱。sCJD的诊断依据《神经病学》(第7版)(人民卫生出版社出版)提供的朊病毒的疑似诊断标准，根据患者临床表现及颅脑MRI、脑电图、肌电图等各项检查结果，临床诊断疑为sCJD。经患者家属同意，采集脑组织块，经PrPSc的蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)检测确诊。本研究遵照中国医学研究委员会和湖北省阳新县妇幼保健院临床项目机构审查委员会的指导文件，经湖北省阳新县妇幼保健院人类研究机构伦理委员会批准。

1.1.3 主要试剂和仪器 限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ及T4连接酶购自日本Toyobo公司。普通琼脂糖凝胶回收试剂盒与质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。PfuDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。His-Tag蛋白纯化柱(Proteinlso Ni-NTA Resin)购自北京全式金生物技术有限公司。磁珠(Dynabeads© M-280 Tosylactivated)购自北京思尔成生物技术有限公司。朊蛋白的鼠抗人单抗3F4购自Prioncs AC公司(瑞士)。辣根过氧化物酶标记的绵羊抗鼠二抗购自Amersham-Pharmacia公司(美国)。蛋白酶抑制剂PMSF购自Merck公司。ECL Kit购自Perkin-Elmer公司。蛋白酶K购自Sigma公司。其他常规分子生物学试剂盒生化试剂均购自国药有限公司。主要仪器包括PCR扩增仪(日本，BIO-Rad 10213型)，琼脂糖凝胶电泳仪(北京市六一仪器制造厂，DYY-8C型)，蛋白电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，JY-SCZ2+)，核酸蛋白微量分析仪(ND2000)，凝胶成像分析仪(北京市六一仪器制造厂，WD-9413B型)，电热恒温水浴箱(北京，HH-W21-C 8600型)，台式高速离心机(上海安亭，TGL-16B)，超声波破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.2 重组子pET-28a-c(+)-G5P的构建

参照文献[5]报道的方法构建重组子。G5P基因由武汉光谷创赢生物技术开发有限公司根据GenBank提供的G5P的基因信息(Accession No.J02450)合成。为了提高G5P重组蛋白在大肠埃希菌中的表达，G5P基因中的原稀有密码子改为偏好密码子。同时在G5P基因的5′和3′端分别引入XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点，具体基因序列信息如图1所示。合成的目的基因和质粒pET-28a-c(+)，分别用EcoRⅠ和XhoⅠ于37℃水浴双酶切4 h，各自回收后，将酶切回收的目的基因和质粒用T4 DNA连接酶于16℃进行连接反应10 h。连接产物即重组子转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，涂布于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB固体培养基上，筛选阳性菌落，提取质粒，利用菌落PCR(特异引物P1：CGGAATTCATGATTAAAGTTGAAATT，P2：ATCTCGAGTTATTTCGCCGGAACCAG)和酶切鉴定法(EcoRⅠ和XhoⅠ)进行重组子的初步验证。将验证正确的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行核酸序列测序。测序结果与设计序列相符的重组子命名为pET-28a-c(+)-G5P。

1.3 重组G5P蛋白的诱导表达与纯化

参照文献[5]报道的最适条件进行。将质粒pET-28a-c(+)-G5P转化E.coliBL21(DE3)，挑取单菌落接种到含卡那霉素(50 μg/mL)的2 mL LB培养液中，37℃、180 r/min过夜培养。次日取菌液50 μL接种到100 mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃、180 r/min过夜培养。第3日将菌液全部移至1 L含卡那霉素的LB培养液中培养至菌液A600=0.5～0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8 mmol/L，37℃、180 r/min继续培养6 h，收集菌液。于4 ℃、8000 r/min离心20 min，弃上清液，细菌沉淀用1/10的裂解液(NaH2PO420 mmo1/L、NaCl 0.5 mol/L、1 % Triton X-100，pH7.4)重悬，超声波破碎，4 ℃、12000 r/min离心20 min，收集上清液，加入终浓度为5 μg/mL的DNase和RNase，30℃水浴30 min。使用Ni+-NTA琼脂糖层析柱纯化上清液中的目的蛋白，进行SDS-PAGE分析。

1.4 重组G5P蛋白偶联磁珠的构建

重组G5P蛋白与磁珠的偶联按照说明书进行。1 mg纯化的重组G5P蛋白与4 mL(约8×109个)P-甲苯磺酰基团修饰的磁珠溶于1 mL PBS，37℃孵育过夜。重组G5P蛋白偶联修饰后的磁珠重悬于含0.1 %牛血清白蛋白的BSA溶液，37℃孵育过夜，以封闭磁珠上未被重组G5P蛋白偶联的P-甲苯磺酰基团位点。

1.5 脑匀浆液的制备

将50 mg的非CJD及sCJD患者脑组织块溶于5 mL裂解液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，0.5% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，10 mmol/L Tris·HCl，pH 7.5)，用研磨器研磨成组织匀浆粗液，4℃、10000 r/min离心4 min，取上清备用。

1.6 重组G5P蛋白偶联磁珠对脑匀浆液的捕获实验

将10 μL非CJD或sCJD患者脑组织匀浆液与重组G5P蛋白偶联磁珠(约8×107个磁珠)一起混合于1 mL结合液(含3% Tween-20，3% NP-40的PBS，pH 7.5)，室温，持续振摇过夜。用磁力将磁珠吸附于管侧壁，弃上清以除去未与重组G5P蛋白偶联磁珠结合的物质。用清洗液(含2% Tween-20，2% NP-40的PBS，pH 7.5)清洗磁珠3次后，将重组G5P蛋白偶联磁珠重悬于Western blot的上样液(3% SDS，2 mmol/L EDTA，10 % glycerol，50 mmol/L Tris，pH 6.8)以进行朊蛋白的Western blot检测。

1.7 朊蛋白的Western blot检测

按照Western blot常规方法进行。分离胶浓度为15%，蛋白电泳条件为电压120 V，30 min，然后150 V，60 min。转膜条件为恒流0.35 A，2 h。一抗为朊蛋白的鼠抗人单抗3F4(1∶50000)，二抗为羊抗鼠多克隆抗体(1∶3000)，ECL显影。

1.8 蛋白酶K水解

为了区分PrPC和PrPSc，在含有朊蛋白的溶液中加入终浓度为50 μg/mL的蛋白酶K，在42℃条件下，混合振荡70 min后，加入终浓度为1 mmol/L PMSF终止反应。水解后的样本进行朊蛋白的Western blot检测。PrPC被蛋白酶K完全水解，Western blot检测无条带显示。PrPSc的空间变化隐蔽了部分蛋白酶K的作用位点，残存未被水解的肽段，Western blot检测有条带显示。

2 结果

2.1 pET-28a-c(+)-G5P重组质粒的构建及验证

菌落PCR结果表明，可获得单一条带，与预期大小一致(图2)。提取PCR阳性菌落质粒，酶切鉴定显示可以切出与目的基因大小一致的片段(图2)。测序结果显示序列完整，阅读框正确，表明成功构建了pET-28a-c(+)-G5P重组质粒(图3)。

2.2 重组G5P蛋白的诱导表达与纯化

结果显示在接近15 kD的区域出现1条明显表达的蛋白条带，该条带与预期表达产物的大小相符(包含重组G5P蛋白及N端的His标签和部分载体序列)；而含pET-28a-c(+)-G5P的未诱导对照组及E.coliBL21(DE3)空菌对照组，在相应位置均未出现明显的目的蛋白条带(图4)，说明重组质粒pET-28a-c(+)-G5P在BL21(DE3)中得以成功表达。在非变性条件下，利用Ni-NTA柱对菌体裂解产物上清中的重组G5P蛋白进行了纯化。SDS-PAGE结果表明，纯化后获得重组G5P蛋白(图4)。

M：DNA ladder；1：合成的目的片段(280 bp)；2：载体质粒pET-28a-c(+)的EcoRⅠ单酶切；3：pET-28a-c(+)-G5P重组质粒的EcoRⅠ单酶切；4：pET-28a-c(+)-G5P重组质粒的EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切；5：菌落PCR扩增目的片段(280 bp)图2 pET-28a-c(+)-G5P重组质粒的鉴定Fig.2 Identification of pET-28a-c(+)-G5P recombinant plasmid

图3 pET-28a-c(+)-G5P重组质粒测序结果Fig.3 Gene sequencing result of pET-28a-c(+)-G5P recombinant plasmid

M：蛋白相对分子质量标准；1：BL21全菌蛋白；2：未诱导的BL21(DE3)-pET-28a-c(+)-G5P全菌蛋白；3：经0.8 mmol/L浓度IPTG诱导的BL21(DE3)-pET-28a-c(+)-G5P全菌蛋白；4：纯化后的重组G5P蛋白图4 重组G5P蛋白的诱导表达与纯化Fig.4 Induced expression and purification of recombinant G5P protein

2.3 重组G5P蛋白偶联磁珠对脑匀浆液的捕获与检测

利用重组G5P蛋白偶联磁珠对脑匀浆液进行捕获，捕获物进行朊蛋白的Western blot检测。结果如图5所示，重组G5P蛋白偶联磁珠能够从脑匀浆液中捕获到朊蛋白，但仅从来自3位sCJD患者的脑匀浆液中捕获到朊蛋白，而从2位非CJD患者的脑匀浆液中未捕获到朊蛋白。该结果提示重组G5P蛋白结合的朊蛋白可能为朊病毒蛋白而非正常朊蛋白。

1～3：重组G5P蛋白偶联磁珠对来自sCJD患者1～3的脑匀浆液的捕获结果；4、5：重组G5P蛋白偶联磁珠对来自非CJD患者1、2的脑匀浆液的捕获结果图5 对捕获物进行朊蛋白的Western blot检测Fig.5 Detection of prion protein in the capture Western blotting

2.4 重组G5P蛋白偶联磁珠捕获的朊蛋白的特征分析

为了深入了解与重组G5P蛋白结合的朊蛋白特征，我们对捕获的sCJD患者1～3的脑朊蛋白用蛋白酶K进行处理，结果发现其具有蛋白酶K抗性，处理后仍可检出Western blot条带。这与正常朊蛋白对照(PrPC)不同，PrPC对照在蛋白酶K(PK)处理后不能检出Western blot条带，但与PrPSc对照的特征相同，两者经蛋白酶K处理后的Western blot条带一致，进一步证明重组G5P蛋白结合的朊蛋白为朊病毒蛋白而非正常朊蛋白(图6)。

1：PrPC对照未经蛋白酶K处理；2：PrPC对照经蛋白酶K处理后；3：PrPSc对照未经蛋白酶K处理；4：PrPSc对照经蛋白酶K处理后；5～7：重组G5P蛋白捕获的sCJD患者1～3的脑朊蛋白经蛋白酶K处理后；M：蛋白Marker图6 重组G5P蛋白捕获的朊蛋白经蛋白酶K处理后的Western blot检测Fig.6 Detection of prion protein in the capture after treatment with PK by Western blotting

2.5 重组G5P蛋白与PrPSc亲和能力分析

为了解重组G5P蛋白与PrPSc的亲和力，我们将sCJD患者3的脑匀浆液进行了500～50000倍的倍比稀释，再经蛋白酶K处理后，用重组G5P蛋白偶联的磁珠进行捕获实验。结果显示(图7)即使稀释10000倍，重组G5P蛋白仍捕获到了PrPSc，表明重组G5P蛋白是一种高亲和力的PrPSc捕获分子。

1：初始浓度；2～6：500、1000、5000、10000、50000倍稀释图7 重组G5P蛋白与低浓度倍比稀释的PrPSc结合能力的分析Fig.7 Binding ability of the recombinant G5P protein to PrPSc

3 讨论

朊病毒病的致病因子是具有感染能力的朊蛋白，即通常所说的朊病毒蛋白，它是由存在于正常宿主细胞表面的PrPC在翻译后发生某些修饰而形成的异常朊蛋白PrPSc。PrPC与PrPSc在结构上存在差异，PrPC包含4个α螺旋结构域，由于不明的原因，其中2个α螺旋结构域异构成β折叠结构，从而转变成具有感染性和致病性的PrPSc。与PrPC不同，PrPSc溶解性较差，对蛋白酶有部分抗性[6]。PrPSc无法被正常的蛋白酶分解，如果沉积在脑组织中会导致神经细胞凋亡，形成脑组织空洞化，引起海绵状脑病，导致宿主迅速死亡。引起PrPC构象变化的内在机制仍不清楚，过去公认的学说为“唯蛋白假说”，该假说认为构象的转化仅涉及蛋白质，未涉及到其他物质，但仍有不少学者对该假说保持质疑，质疑的核心问题为是否仅有朊蛋白起作用，是否还有未检出的核酸参与。

目前临床上缺乏早期诊断朊病毒病的方法，通常是在临床症状出现后，进行脑组织解剖，利用脑组织标本进行免疫组织化学检测，若显示有海绵状改变和朊病毒聚集方可确诊。由于缺乏能够区分PrPC和PrPSc的抗体，所有检测PrPSc的经典方法均依赖于蛋白酶预处理，但这可能会漏诊一些对蛋白酶敏感的PrPSc，这种PrPSc在蛋白酶K处理后被降解，因此无法检出[7]。在过去的20年中一些研究小组发现核酸，即RNA和DNA对于朊病毒的转化和扩增具有重要的作用[4，8-12]。这些分子能够在体外诱导PrPC向PrPSc的构象转变，导致有毒或无毒性聚集物的形成。鉴于核酸可能参与PrPSc的形成，有学者尝试对一些抗DNA抗体或是DNA结合蛋白进行筛选，以期获得能从病变大脑匀浆中捕获PrPSc的抗DNA抗体或是DNA结合蛋白[4，13]。令人惊讶的是，一种来源于丝状噬菌体的单链DNA结合蛋白能够特异性结合PrPSc而不与PrPC结合。该蛋白为丝状噬菌体的一种非结构蛋白，被称为G5P。G5P由87个氨基酸残基组成，为噬菌体DNA复制所必需，可使噬菌体DNA移动至细菌的细胞膜，该蛋白还可抑制翻译活性，在病毒、原核生物的DNA复制、翻译及遗传重组等过程中发挥重要作用[14-16]。研究发现G5P蛋白与PrPSc的结合具有以下的特点：只与PrPSc结合，而不与PrPC结合；结合具有高亲和力；结合与PrPSc的构象相关，可能涉及DNA或DNA相关分子在内的复合体；既可结合蛋白酶敏感型PrPSc，也可结合蛋白酶不敏感型PrPSc。以上发现预示着G5P将在PrPSc诊断和机制研究中具有应用价值。

由于野生型G5P在细菌中的含量较低且不易收集与纯化。本研究利用基因克隆技术表达、纯化重组G5P蛋白，并考察重组G5P蛋白结合PrPSc的能力。为了实现G5P基因在大肠埃希菌中的高效表达，本研究采用基因全合成的方式，使用大肠埃希菌偏爱密码子替换原密码子，从基因水平上进行优化。丝状噬菌体编码的G5P蛋白为87个氨基酸残基，分子质量为9682 D。本实验得到的重组G5P蛋白的相对分子质量约为13 kD，由偏爱密码子替换后的全长G5P基因与载体pET-28 a(+)中表达氨基末端的一段6×His标签的序列及载体部分序列进行融合表达获得，这样即可实现G5P蛋白在宿主菌中的高效表达，同时His标签又为后续的重组蛋白分离纯化提供了方便，利用重组蛋白上His标签与Ni+亲和层析柱间高的亲和力，洗涤杂蛋白从而获得纯化G5P蛋白。

通过捕获实验，我们发现获得的带His标签重组G5P蛋白可以捕获PrPSc，因此不需要利用凝血酶(thrombin)切除His标签，从而大大节约了制备成本与时间。与天然G5P蛋白相似，重组G5P蛋白结合PrPSc具有特异性，只能从CJD患者的脑匀浆液中捕获到朊蛋白，而从非CJD患者的脑匀浆液中未捕获到朊蛋白。捕获的朊蛋白经蛋白酶K处理后仍能检出Western blot条带，且具有高亲和力的特点，进一步证明重组G5P蛋白结合的朊蛋白为朊病毒蛋白而非正常朊蛋白。重组G5P蛋白结合PrPSc具有高亲和力，将sCJD患者的脑匀浆液稀释10000倍，重组G5P蛋白仍可捕获到PrPSc，表明重组G5P蛋白是一种高亲和力的PrPSc捕获分子。

以上结果预示重组G5P蛋白可用于开发新型的PrPSc诊断试剂。与传统的抗朊蛋白抗体相比，重组G5P蛋白的检测更具优势，一方面，G5P对PrPSc的特异性结合是构象依赖性的，检测并不需要蛋白酶K的处理，这意味着可以直接检测PrPSc，而不需要进行蛋白酶K预处理；另一方面，越来越多的研究发现，存在具有感染性、致病性，但对蛋白酶K没有抵制能力的PrPSc。对于这些PrPSc，传统的抗体无法检测，而G5P与PrPSc结合是构象依赖性的，则可以在这些PrPSc的检测上发挥不可替代的作用；此外，由于G5P与PrPSc的结合是在天然条件下，不需要变性剂的存在，这一特点有别于抗体，因此基于G5P蛋白的检测方法将具有活体内检测的应用前景。鉴于重组G5P蛋白是一种高亲和力的PrPSc捕获分子，它还可用于开发新型的PrPSc的滤除设备，特别是用于去除血液中的PrPSc，这将对预防PrPSc的输血感染，保障输血安全具有重要作用。

综上所述，本研究利用基因克隆技术成功获得了纯化的重组G5P蛋白。该蛋白具有特异性结合PrPSc的能力，并具有较高亲和力，这为下一步研发新型朊病毒检测技术和滤除技术打下基础。