TRPC6通过AKT/GSK-3β和ERK信号通路抑制心肌纤维化的形成*

吴奇芳，廖燕宏，2△

华中科技大学同济医学院，1解剖学系，2神经系统疾病教育部重点实验室，武汉 430030

异丙肾上腺素(isoprenaline，ISO)是临床上一种常见的β肾上腺素能受体激动剂，心悸、心绞痛、高血压等是ISO常见的副作用。这些副作用的长期存在可引起心肌的病理性重构，加之ISO本身的细胞毒性可能会造成心肌细胞的损伤，因而会促进心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)的发生。MF是心肌组织在受到各种内外环境损伤时发生的一种病理性改变，其主要的组织学表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在心肌间质内的过度沉积及肌成纤维细胞的聚集。Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ，COL-1)是ECM中的主要蛋白质，在发生MF时表达量显著升高。α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)被认为是成纤维细胞活化后向肌成纤维细胞转化的标志，心肌组织中α-SMA蛋白表达量的增高也可提示MF的发生。

经典瞬时受体电位通道(transient receptor potential canonical，TRPC)是一种广泛表达在心脏、肾脏、脑等各种重要脏器中的非选择性阳离子渗透通道[1]，与多种脏器的多种疾病息息相关。TRPC通道以同源或异源四聚体的形式，调节细胞内的钙离子(calcium，Ca2+)浓度。TRPC通道所介导的胞内Ca2+浓度的增高，是某些信号通路激活的前提，其在诸如心肌肥大、心肌纤维化等心血管疾病发病机制中起着重要作用。TRPC通道与脏器纤维化之间的关系在近期常被报道，且蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)/糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)和胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)蛋白的相关通路一直是纤维化研究领域的热点。但是，利用TRPC6基因敲除(TRPC6 knockout，TRPC6-/-)小鼠探究TRPC6通过AKT/GSK-3β和ERK信号通路对ISO诱导心肌纤维化产生影响的相关研究尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

本实验所用的野生型(wild type，WT)小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，TRPC6-/-型小鼠由美国NIH/NIEHS Lutz Birnbaumer实验室提供。异丙肾上腺素粉剂购于Sigma公司；组织化学染色试剂盒购于北京Solarbio公司；纤维化相关指标抗体及通路抗体购于CST公司。

1.2 模型构建与分组

取6～8周龄(体重约20～25 g)WT和TRPC6-/-成年雄性健康小鼠各40只，使用生理盐水(Saline)或ISO对小鼠进行腹腔注射，将小鼠按基因型和用药的不同随机分为以下4组：WT Saline组；WT ISO组；TRPC6-/-Saline组；TRPC6-/-ISO组，每组20只。Saline组小鼠使用生理盐水，ISO组小鼠使用ISO，分别连续行腹腔注射10 d，注射剂量为每只小鼠50 mg/(kg·d)，给药间隔为24 h，建立小鼠心肌纤维化模型。

1.3 小鼠的一般生存情况记录

每日对小鼠的一般生存情况进行观察并记录。

1.4 心肌组织的固定与取材

麻醉小鼠，将其固定并打开胸腔，充分暴露心脏。由心尖部将静脉注射针头插入左心室适量长度，剪开右心耳，推注50 mL预热的生理盐水后更换为4%的多聚甲醛继续匀速推注，至小鼠全身肌肉僵直后停止，剪取心脏，移入4%多聚甲醛液体中固定24 h待用。

1.5 心肌组织形态结构观察及结果判读

取固定好的小鼠心脏的心室分别行石蜡及OCT(optimal cutting temperature compound)包埋剂包埋后切片，而后分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)、Masson、天狼猩红及免疫荧光染色，光学显微镜及共聚焦显微镜下分别观察并采集图像。

结果判读：HE染色可显示心肌组织内炎性细胞浸润、细胞变性及心肌细胞排列情况；Masson、天狼猩红染色可显示组织内沉积的胶原纤维以及心肌排列情况。

1.6 组织蛋白的提取

麻醉小鼠后剪取心尖组织，放入裂解液内充分研磨，研磨后行超声破碎，而后进行离心(12000×g，30 min)。离心后取上清液，加入相应体积的上样缓冲液(loading buffer)振荡混匀，热水浴变性蛋白。

1.7 Western blot(WB)检测心肌组织纤维化指标及通路蛋白表达水平

变性好的蛋白进行电泳、转膜、封闭、相关一抗孵育(工作浓度1∶1000)，二抗孵育(工作浓度1∶2500)，TBST洗涤后使用ECL法显影并采集图像。通过Image Lab、Image J软件对条带强度进行分析，以GAPDH作为内参，测定相关指标的表达水平。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠的一般生存情况

对小鼠的一般生存情况进行动态记录，结果显示：注射Saline的两组小鼠一般状态良好。与Saline组相比，ISO组小鼠表现出明显的精神状态欠佳，活动度下降，毛发粗糙且无光泽。注射Saline的两组小鼠10 d内均没有死亡，注射ISO的两组小鼠中：WT ISO组小鼠死亡11只，存活9只；TRPC6-/-ISO组小鼠死亡7只，存活13只。对小鼠的存活及死亡数量进行统计分析可知，在为期10 d的腹腔注射周期中，注射ISO的两组小鼠死亡率明显增高，但TRPC6-/-ISO组小鼠死亡率较WT ISO组小鼠低，且差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 敲除TRPC6对ISO导致的小鼠心肌纤维化的影响

2.2.1 TRPC6在各组小鼠心肌组织中的表达 取各组小鼠的心肌组织行免疫荧光染色，并对WT两组进行WB检测，观察各组小鼠TRPC6蛋白的表达情况。免疫荧光结果显示：WT Saline组小鼠的心肌组织中可见基础的TRPC6表达量，而WT ISO组小鼠的心肌组织中TRPC6表达量明显增高；TRPC6-/-Saline组及TRPC6-/-ISO组小鼠心肌组织中TRPC6表达量均较低，统计学分析表明，WT ISO组与其他3组比较差异有统计学意义(均P<0.05)(图1A)。本实验室此前关于心肌缺血再灌注研究中的WB结果显示，TRPC6-/-小鼠心脏组织中几乎无TRPC6通道蛋白的表达[2]。本研究中WB检测结果显示：较WT Saline组小鼠，WT ISO组小鼠心脏组织中TRPC6蛋白表达量明显增加，且差异有统计学意义(P<0.05)(图1B)。

2.2.2 各组小鼠心肌组织的形态学变化及TRPC6敲除对纤维化相关蛋白表达的影响 HE染色，光学显微镜下可见，注射Saline的两组小鼠心肌组织结构清晰，形态正常，心肌细胞排列整齐有序，无水肿，未见明显炎性细胞浸润；WT ISO组小鼠心室壁增厚，心肌细胞排列紊乱，伴心肌细胞明显水肿坏死及间质内大量炎性细胞浸润；TRPC6-/-ISO组小鼠心肌细胞形态大致正常，排列紊乱程度较轻，炎性细胞浸润较少。Masson及天狼猩红染色提示，注射Saline的两组小鼠心脏未见明显胶原沉积；WT ISO组小鼠心室内侧壁可观察到胶原纤维沉积明显增加，心肌层次排列极其紊乱；与WT ISO组小鼠相比，TRPC6-/-ISO组小鼠心肌组织内胶原纤维沉积减少(图2A)。

A：各组小鼠心肌组织中TRPC6蛋白荧光水平(标尺=50 μm)；B：WT组小鼠心肌组织中TRPC6蛋白表达水平；*P<0.05，**P<0.01图1 TRPC6通道蛋白在CF小鼠心肌组织中的表达水平Fig.1 Expression level of TRPC6 channel protein in myocardial tissue of CF mice

本研究中WB结果提示，与注射Saline的两组相比，注射ISO的两组小鼠心肌组织内α-SMA及COL-1蛋白表达量均有增加，但TRPC6-/-ISO组小鼠较WT ISO组小鼠心肌组织内α-SMA及COL-1蛋白表达量可见明显降低，差异有统计学意义(均P<0.05)(图2B)。

A：各组小鼠心肌组织病理改变(标尺=50 μm)；B：各组小鼠心肌组织中纤维化相关蛋白表达水平；*P<0.05 **P<0.01图2 TRPC6-/- 对小鼠心肌组织纤维化的影响Fig.2 Effects of TRPC6-/- on myocardial fibrosis in mice

2.3 TRPC6敲除对AKT/GSK-3β和ERK信号通路相关蛋白的影响

对各组小鼠的心肌组织进行AKT/GSK-3β和ERK信号通路内相关蛋白检测，结果显示：腹腔注射ISO的两组小鼠心肌组织内磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-protein kinase B，p-AKT)、磷酸化糖原合酶激酶-3β(phosphorylated-glycogen synthase kinase-3β，p-GSK-3β)及磷酸化胞外信号调节激酶(phosphorylated-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)蛋白表达量均增加，但TRPC6-/-ISO组小鼠的p-AKT、p-GSK-3β及p-ERK蛋白表达量低于WT ISO组小鼠，差异有统计学意义(均P<0.05)(图3)。

*P<0.05，**P<0.01图3 TRPC6-/- 对小鼠心肌组织中AKT/GSK-3β和ERK信号通路的影响Fig.3 Effects of TRPC6-/- on AKT/GSK-3β and ERK signaling pathways in myocardial tissue of mice

3 讨论

心脏是由心肌为主构成的人体最重要的器官之一，其主要功能是为血液循环提供动力，使其得以运行至全身各个部分。当机体所处的各种内外环境改变导致心肌损伤后，可引起MF。心脏内的成纤维细胞在各种损伤刺激下活化后向肌成纤维细胞转化，分泌大量以Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白为主的相关蛋白质，并沉积在ECM中[3]。根据既往研究显示，心脏内Ⅰ型胶原蛋白含量增加会明显增加组织硬度，导致MF进一步加重。α-SMA是细胞骨架蛋白微丝系统的一部分，在肌成纤维细胞和肌上皮细胞中表达。当心肌组织发生MF时，α-SMA是成纤维细胞活化的一个标志，提示MF改变。MF是一种常见的心脏病理性重塑，可引起心室壁僵硬，心脏收缩力降低，心脏整体性能受损，以及心脏传导功能异常，包括心律失常[4-5]、心肌肥厚[6]和心力衰竭[7]等。同时，各类心脏疾病也会导致心肌纤维化的发生并加速MF所致的心力衰竭的进展，例如高血压性心脏病、扩张型心肌病、缺血性心肌病及炎症性心脏病[8]等，从而大大影响了患者的预后及病死率。因此，针对MF的药物研究对现代心脏病学具有重大意义。

TRPC超家族包括7个亚型，分别是TRPC1～7，其中TRPC2亚型在人类体内是伪基因。根据序列对比和功能比较，哺乳动物体内的TRPC通道又可被分为TRPC1、TRPC2、TRPC3/6/7和TRPC4/5等4个亚家族[9]。在绝大多数的主要器官中，TRPC通道普遍表达并有助于各器官的正常发育和功能，其功能失调常与多种器官疾病的发生和进展有关。TRPC通道基因与组织纤维化的关系在越来越多的文献中被论述：TRPC6在各种蛋白尿性肾脏疾病中起到关键作用，且TRPC6通道基因的突变可导致严重的肾病综合征，进一步导致终末期肾病，发生肾脏纤维化[10]；TRPC6的表达上调可促进克罗恩病中狭窄性肠纤维化的发生；TRPC3通道蛋白参与肾小管间质损伤和梗阻性肾病中纤维化的发生[11]；敲低TRPC3通道蛋白，可显著抑制人心肌细胞和心肌成纤维细胞的纤维化反应；下调肝窦内皮细胞中TRPC3的表达，可降低其对内质网应激所诱导的凋亡的敏感性[12]。另外，TRPC通道功能的障碍涉及多种心血管疾病，与心脏的病理性重构也表现出关联性。然而，在小鼠的心肌组织中仅表达TRPC 7个亚型中的5个，其中TRPC5和TRPC7不表达[2]。本实验室之前的研究中探究了TRPC3和TRPC6在心肌缺血再灌注中的作用，结果显示，在心脏发生缺血再灌注时，心肌细胞可通过CaMKⅡ-Calcineurin-NFAT3c信号途径，正反馈增高TRPC3和TRPC6的表达[2]。另有研究亦表明，体内的选择性TRPC6抑制剂BI749327，可有效抑制小鼠心脏、肾脏的应激性纤维化和功能障碍[13]。但是，利用TRPC6-/-小鼠对ISO诱导的心肌纤维化的相关探究未见报道。

作为一种临床上常用的β肾上腺素能受体激动剂，ISO可对心肌组织造成损伤从而导致组织内炎症，继而引起心肌组织间成纤维细胞过度增殖和ECM过度积累[14]，产生修复性纤维化。在关于MF相关通路的研究中，转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smads、AKT/ GSK-3β和ERK等蛋白相关信号通路一直是探究的热点。本研究通过对小鼠进行连续大剂量的ISO腹腔注射，构建小鼠心肌纤维化模型，探究TRPC6通道通过介导AKT/GSK-3β和ERK信号通路对ISO诱导的小鼠MF的影响。

通过对各组小鼠的一般生存情况进行动态观察，结果显示，注射ISO的两组小鼠均有一定程度的一般状态变差及死亡，但与WT小鼠相比，TRPC6基因敲除能有效改善ISO注射后小鼠的一般情况，并降低小鼠的死亡率。利用组织免疫荧光技术及WB分析也显示，WT ISO组小鼠心肌组织中TRPC6蛋白表达量明显高于WT Saline组小鼠，提示TRPC6可能参与ISO诱导的小鼠心肌纤维化过程。同时，本研究组织化学及WB分析的结果显示，ISO可以诱导WT及TRPC6-/-小鼠发生MF，但与WT小鼠相比，TRPC6-/-小鼠的心肌组织内浸润的炎性细胞及沉淀的胶原蛋白明显减少，α-SMA和COL-1蛋白表达水平下降。上述结果提示，敲低TRPC6基因表达可能抑制心肌组织损伤后纤维化的形成。

AKT/GSK-3β和ERK的相关通路是组织纤维化研究领域的热点。小鼠主动脉缩窄术引发小鼠心肌间质纤维化的模型中，阿司匹林可能通过下调ERK、减少p-AKT的表达，阻断丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/ERK以及p-AKT/ β-连环蛋白(β-catenin)通路，抑制心肌成纤维细胞中胶原的生成以及主动脉缩窄模型小鼠的MF[15]。有研究证明，GSK-3β可有效抑制胶原蛋白的产生，然而p-GSK-3β可抑制其活性，并促进胶原蛋白的沉积。在血管紧张素Ⅱ灌注模型中，小分子Dickkopf(DKK)3蛋白的过表达可通过调节GSK-3β/β-catenin通路灭活p-GSK-3β，从而减轻MF[16]。ERK相关信号通路在多种器官的纤维化中起到关键作用，例如血管紧张素Ⅱ诱导增加大鼠体内肾素分泌，从而激活大鼠体内氧化应激、炎症反应和MAPK/ERK通路，并同时造成相关的器官损伤，如肾脏和心脏的肥大以及纤维化[17]。本实验结果表明，ISO组小鼠心肌组织的p-ERK、p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达量明显增高，但TRPC6-/-ISO组小鼠心肌组织中的p-ERK、p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达量较WT ISO组小鼠明显降低。表明敲低TRPC6基因可能通过AKT/GSK-3β和ERK信号通路抑制MF的发生和发展。

综上所述，本实验的研究结果表明，在ISO的持续性损伤刺激下，心肌细胞内TRPC6表达上调，且TRPC6可通过调控AKT/GSK-3β和ERK的磷酸化水平，来发挥其在MF发生发展中的作用。敲除TRPC6基因可减轻ISO所诱导的MF。因此，本研究提示TRPC6可能成为改善和攻克MF的全新治疗靶点，为MF的治疗提供了崭新的思路。