表皮生长因子受体抑制剂对氧糖剥夺/复氧诱导的血脊髓屏障损伤的保护作用研究

李在望，姜冬梅，韩晶，涂景梅，王倩

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后往往会造成受损平面以下肢体和躯干严重的运动、感觉功能缺损，大小便及性功能障碍，且这些缺损往往不可逆[1]。SCI后的神经功能缺损由原发性损伤和继发性损伤所造成。原发性损伤是指原发疾病对脊髓造成的直接损伤，而继发性损伤与SCI后过度炎症反应及血脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）的破坏密切相关[2]。因此，SCI后如何控制炎症反应和保护BSCB结构和功能的完整是减轻继发性损伤的关键环节。

BSCB是中枢神经系统（central nervous system，CNS）特有的屏障结构，与血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）类似，其主要由脊髓微血管内皮细胞、星形胶质细胞、血管周围的小胶质细胞、周细胞及基膜组成，是维持脊髓神经组织微稳态的高选择性屏障结构[3]。目前有研究证实，在SCI后，BSCB结构的主要组成细胞（微血管内皮细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞）出现表皮生长因子受体（epidemical growth factor recepter，EGFR）的大量活化[4-6]。EGFR是位于细胞质膜上的受体型酪氨酸蛋白激酶（tyrosine-protein kinase，TPK），在细胞存活、生长、分化、增生及凋亡等信号转导通路中起着关键性调节作用[7]。研究发现，EGFR信号通路参与细胞屏障功能的调节，而微血管损伤、肺损伤及肠道内膜的通透性异常改变均与EGFR活化相关[8]。

有研究证实EGFR抑制剂能改善SCI后神经功能缺损症状[5,6,9]，推测其机制可能与维持SCI后BSCB完整性，减轻脊髓继发性损伤有关。本实验通过建立BSCB体外模型，给予氧糖剥夺/复氧（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）处理，应用EGFR抑制剂PD168393对损伤的BSCB进行干预，观察内皮细胞通透性、紧密连接蛋白的表达及BSCB细胞分泌炎症因子的变化，以探讨EGFR抑制剂PD168393对BSCB通透性的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

①实验动物：新生24 h内SD大鼠10只，购自常州卡文斯实验动物有限公司。②主要试剂：PD168393购于德国Calbiochem公司；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-右旋糖酐（dextranum）（F-D）购于美国Sigma公司；兔抗Occludin、小鼠抗ZO-1抗体均购于Invitrogen公司；白细胞介素（interleukin，IL）-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-αELISA试剂盒均购于美国R&D公司；诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）ELISA试剂盒购于AVIVA公司。

1.2 方法

1.2.1 建立体外BSCB模型培养原代大鼠来源的脊髓微血管内皮细胞和混合胶质细胞，细胞95%融合后进行消化，重悬后以5×104/mL密度取1 mL接种在12孔板Transwell（聚酯膜，直径12 mm，孔径0.4μm）下室，作为滋养层；脊髓微血管内皮细胞取200μL接种在上室（Transwell嵌套内），建立上下双层细胞共培养体系。贴壁后每2天换液1次。常规培养约7 d后，Transwell嵌套内脊髓微血管内皮细胞即可形成内皮细胞屏障样组织，模拟BSCB组成细胞间的相互作用，建立体外BSCB模型[10]。

1.2.2 细胞分组①将体外培养的BSCB模型分为3组：对照组、损伤组和治疗组。②损伤组和治疗组细胞用PBS清洗上、下室3次，加入无糖无血清DMEM培养基；将Transwell及校准的测氧仪放入预缺氧小室中，通入95%N2，5%CO2直至测氧仪调至0.0～0.2，制造无氧环境。在培养箱内培养6 h后，将2组细胞取出，更换为正常糖、血清的培养基，放入饱和湿度、正常含氧细胞培养箱中进行复氧（此时氧浓度约20%），复氧时间分别为3 h、6 h和12 h；其中治疗组在复氧开始时即给予10 nM PD168393进行干预（给药浓度参照既往研究报道）[11]。对照组细胞用含糖、含血清的DMEM/F-12完全培养基洗涤3次，然后继续放入正常温度和含氧度的培养箱中培养。

1.2.3 荧光染料渗漏实验将上述处理3组的上室培养液除去，在Transwell嵌套中加入200μL FITC-右旋糖酐（F-D）（1 mg/mL），置于培养箱中30 min。从各组底室分别取100μL（每孔取3次）置于96孔板，加入不同已知浓度的F-D，用荧光检测仪在540 nm处读取各孔溶液的荧光强度。根据标准曲线，计算各组渗透到底室的F-D浓度，评估渗透性随时间的变化趋势。

1.2.4 跨膜电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）测量使用来自美国EMD Millipore公司的Millicell ERS-2电阻仪测量3组在不同复氧时间点的TEER值。单位面积电阻/(Ω×cm2)=(所测得电阻值-空白电阻值)×有效膜面积（本实验采用12孔板Tranwell系统，有效生长膜1.13 cm2）。

1.2.5 免疫荧光染色当各组细胞爬片的细胞长至95%融合时，取出爬片，常规4%多聚甲醛固定15～20 min，0.2%Triton/PBS液室温透膜15 min，山羊血清白蛋白室温封闭1 h，加预先用抗体稀释液稀释的一抗，于4℃冰箱中孵育过夜，用PBS替代一抗作为阴性对照；滴加二抗(1∶300)，室温避光孵育1 h；加核染料DAPI工作液（1 mg/mL），室温复染5 min；50%甘油封片；于荧光显微镜下观察并照相；上述每一步操作间均用PBS洗5 min/次×3次。

1.2.6 Western Blot法OGD/R后6 h，收集各组细胞，加入裂解液冰上孵育并彻底匀浆，离心后留取上清，BCA法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；全湿式电转法转移到PVDF膜上；5%封闭液封闭2 h，分别加入一抗兔抗Occludin、小鼠抗ZO-1（1∶1000）；内参为GAPDH（1∶500），4℃孵育过夜。用TBST溶液洗涤10 min/次×3次；加入HRP标记羊抗鼠、羊抗兔IgG二抗（1∶1000），4℃过夜；TBST洗膜10 min/次×3次，加ECL发光显示液在暗室中摄像，凝胶成像分析系统进行分析。

1.2.7 ELISA法ELISA法测定各组细胞分泌的致炎因子IL-6、TNF-α、iNOS，具体操作步骤按ELISA试剂盒的说明进行。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件处理数据。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR抑制剂对OGD/R诱导的BSCB损伤模型通透性的影响

对照组渗透到底室F-D的平均浓度为（230±34）nmol/L；损伤组的F-D浓度在复氧3 h、6 h和12 h分别为（280±53）nmol/L、（300±57）nmol/L和（270±42）nmol/L，均高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）；治疗组的F-D浓度在复氧3 h、6 h和12 h分别为（240±39）nmol/L、（250±40）nmol/L和（238±33）nmol/L，均低于损伤组（均P＜0.05），见图1 A。损伤组的TEER值在复氧3 h、6 h、12 h后均低于对照组（均P＜0.01），而治疗组在这3个时间点，所测TEER值均高于损伤组（均P＜0.05），见图1B。

2.2 EGFR抑制剂对OGD/R诱导的BSCB损伤模型紧密连接蛋白表达的影响

与对照组相比，损伤组紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达量显著降低（均P＜0.05），而治疗组ZO-1和Occludin的表达量较损伤组显著升高（均P＜0.05），见图2A、B。免疫荧光染色结果显示，对照组细胞排列紧密，呈条索状排列，符合正常内皮细胞生长形式，紧密连接蛋白ZO-1和Occludin在细胞间呈连续性的线条样外观，见图2C1、D1；损伤组ZO-1和Occludin表达量显著下调，线条显著变细，部分线条断裂或部分缺损，见图2C2、D2；治疗组ZO-1和Occludin荧光线条虽仍有缺损，但较损伤组的断裂和缺损均明显减少，表达均有所增加，见图2C3、D3。

2.3 EGFR抑制剂对OGD/R诱导的BSCB损伤模型致炎因子表达的影响

ELISA结果显示，与对照组相比，损伤组分泌的致炎因子IL-6、iNOS、TNF-α均显著上调。IL-6在OGD/R 6 h时表达量增幅最大，见图3A。iNOS、TNF-α在OGD/R后的表达也增加，呈缓慢上升的趋势，见图3B、C。OGD/R 12 h时，损伤组IL-6、iNOS分泌逐渐减少，而TNF-α仍有持续的高表达。治疗组在各时间点致炎因子IL-6、iNOS、TNF-α的分泌均较损伤组显著下调（均P＜0.05），见图3。

3 讨论

BSCB是CNS高度分化的神经血管特殊化内皮结构，而微血管内皮细胞是BSCB重要组成细胞[3]。紧密连接蛋白是微血管内皮细胞分泌的一种特殊蛋白，可填补内皮细胞间隙，使内皮细胞形成紧密连接状态，对BSCB的功能维持有极其重要的意义[12]。ZO-1和Occludin是紧密连接的主要蛋白质，也被认为是CNS屏障结构正常或损坏时的敏感标记物[12]。Occludin是第1个被发现的完整的紧密连接膜蛋白，分子量56 kDa，可以通过羧基与ZO-1连接[12]。Occludin在CNS血管内皮上的表达较非神经组织的高，这是BBB与BSCB通透性明显低于其它血组织屏障的重要原因之一[12]。ZO-1蛋白不仅作为细胞内多个信号通路的支架，也涉及紧密连接蛋白的调节功能[12]。在SCI的过程中，ZO-1通过辅助紧密连接装配、传递相邻细胞间的信号、影响血管内皮细胞的基因表达等途径，参与BSCB通透性变化的过程[13]。

图1各组BSCB在OGD/R处理后的通透性

图2 EGFR抑制剂对OGD/R处理后BSCB紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达量的影响

有研究证实在SCI后BSCB通透性增大，紧密连接蛋白表达减少[14,15]。本研究构建体外BSCB模型OGD/R损伤后，免疫荧光显示损伤后的BSCB紧密连接蛋白表达减少，荧光染料渗漏实验及内皮细胞跨膜电阻检测均证实BSCB在损伤后通透性明显增加，说明BSCB的结构破坏、屏障功能受损。在western blot和免疫荧光检测中发现，治疗组紧密连接蛋白的表达较损伤组增加，说明EGFR抑制剂有助于减轻BSCB损伤后紧密连接蛋白的破坏。本研究结果还显示，体外BSCB在OGD/R损伤后致炎因子（TNF-α、IL-6、iNOS）分泌明显增加，而应用EGFR抑制剂干预后致炎因子的表达明显下调。有研究证实致炎因子的表达与紧密连接蛋白表达呈负性相关，抑制过度的炎症反应可减少紧密连接蛋白缺失，保护BSCB完整性[10]。

目前有多个研究证实EGFR抑制剂对CNS损伤有保护作用[5-7,9]，但其作用机制一直未完全明确。目前有研究证实SCI后活化的星形胶质细胞和小胶质细胞均出现EGFR大量活化，EGFR抑制剂既能有效抑制星形胶质细胞和小胶质细胞EGFR活化，又能明显抑制过度的胶质增生[5,6,9]。SCI后BSCB的破坏和胶质细胞活化引发的炎症反应是导致脊髓继发损伤的2个关键病理改变[16]。SCI后BSCB破坏导致血液中白细胞和致炎因子进入神经组织，激活星形胶质细胞、小胶质细胞[2]。胶质细胞活化后引发炎症损伤反应，不仅导致神经元和少突胶质细胞损伤，还进一步破坏BSCB的完整性，使脊髓继发性损伤作用不断放大，形成脊髓组织炎症损伤的恶性循环（即正反馈损伤）[10,17]。阻断这一炎症损伤的恶性循环是治疗SCI的一个重要策略。根据本研究结果，我们推测在BSCB损伤后应用EGFR抑制剂，可能通过抑制胶质细胞EGFR的活化而减缓胶质细胞的过度增生，减少过度的炎症反应所造成的炎症损伤，起到保护BSCB的作用。

综上所述，EGFR抑制剂PD168393可减少BSCB在OGD/R损伤后致炎因子的表达，并减少BSCB紧密连接蛋白的脱失，维护BSCB的完整性。

图3 EGFR抑制剂对OGD/R处理后BSCB分泌致炎因子的影响