血神经屏障和Claudin-1蛋白在大鼠慢性神经病理性疼痛中的作用

杨少兵，胡柳，迟晓慧，张志发

神经病理性疼痛是神经系统受损导致的慢性或持续性疼痛，其主要特征是自发痛、痛觉过敏、触诱发通和感觉异常，并在神经损伤后持续很长时间，严重影响患者的生活质量。目前关于神经病理性疼痛的发病机制尚未明了，且对其治疗也存在很多缺陷。深入探索疼痛的发病机制，寻找疼痛治疗靶点，对提高疼痛治疗效果有着深远的意义。

最近研究表明血神经屏障（blood nerve barrier，BNB）参与神经病理性疼痛的发生发展[1]。BNB主要由神经束膜和神经内膜组成，正常情况下能够维护神经内环境稳定，保护神经纤维。但在某些病理状态下（如坐骨神经受损后），BNB通透性增加，屏障功能减弱[2]，外周的纤维蛋白原及炎性因子穿过通透性增加的BNB，作用于外周神经导致痛阈值降低，参与慢性疼痛的病理过程[3]。但BNB在疼痛中的具体调节机制尚不清楚。紧密连接是BNB的结构基础之一，密封蛋白（Claudin）-1是紧密连接蛋白中最重要的一种，Claudin-1表达下降导致BNB通透性增加[4]，可能是慢性疼痛发生发展的关键环节。本研究拟制备慢性坐骨神经压迫损伤（chronic constriction injury of sciatic nerve，CCI）模型大鼠，观察Claudin-1和BNB通透性的变化，探讨其在慢性神经性疼痛中的具体作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

清洁级雌性SD大鼠，体质量180～200 g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。伊文斯蓝（Evans blue，EB）购自美国Sigma Aldrich公司；兔抗Claudin-1单克隆抗体购自德国Life Technologies公司（货号51-9000），β-actin抗体购自Sigma Aldrich公司（货号#A3854），Lumi-Light荧光试剂盒和DAPI均购自德国Roche公司。逆转录PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）引 物 购 自 德 国MWG Eurofins公司。

1.2 方法

1.2.1 分组所有大鼠随机分为3组，对照组（Control组），假手术组（Sham组）和慢性疼痛组（CCI组），各组6只。后续实验中，每组大鼠各时间点均提取6样标本进行各项实验检测。对照组不做处理；另外2组大鼠经10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，分离暴露右侧坐骨神经，Sham组仅暴露不结扎，CCI组用4/0丝线在坐骨神经上打4个松结，每个结间隔1 mm，结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动为宜。

1.2.2 行为学观察3组共18只大鼠均在实验前1 d及术后6 h、1 d、7 d和14 d进行机械性触诱发痛测定。将透明有机玻璃箱放置于实验台的铁丝网架上，待测大鼠置于箱中适应15 min后，用Von-frey丝垂直刺激小鼠右后肢的足底中部，使之稍弯成S形，持续时间不超过4 s，出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。当该力度的刺激不能引起阳性反应时，则给予相邻大1级力度的刺激；如出现阳性反应时，则给予相邻小1级力度的刺激；如此连续进行，每次间隔15 s。计算出50%缩足阈值，绘制大鼠机械性触诱发痛曲线。

1.2.3 BNB渗透检测1%EB溶于5%牛血清白蛋白制备成伊文斯蓝蛋白染剂（Evans blue albumin，EBA）。3组共18只（n=6）大鼠术后1 d提取坐骨神经，4%多聚甲醛固定90 min后，将其浸泡于2 mL的EBA溶液中1 h，再次甲醛固定，OCT胶包埋后切片，显微镜下拍照。每只大鼠取1张图片，用Image J软件测量神经内部EBA总灰度值，计算平均密度，以评价BNB通透性。

1.2.4 RT-PCR为节约实验动物，Control组（未做任何处理）只取6只大鼠的坐骨神经作为所有时间点的阴性对照。3组共66只大鼠（n=6），分别于术前及术后6 h、1 d、7 d和14 d，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠后处死，提取坐骨神经。采用Trizol提取液提取坐骨神经总RNA，Nanodrop 2000分光光度计上测量总RNA浓度，使用cDNA-kit试剂盒逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应。引物序列：Claudin-1，上游引物：5’-GGGACAACATCGTGACTG CT-3’，下游引物：5’-CCACTAATGTCGCCAGACCTG-3’；GAPDH，上游引物：5’-AGTCTACTGGCGTCTTC AC-3’，下游引物：5’-TCATATTTCTCGTGGTTCAC-3’。扩增反应条件：95℃预变性10 min，随后95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min，40个循环。以循环阈值（Ct值）作为统计参数，GAPDH为内参，结果数据利用Applied Biosystems 7300 SDS软件，采用2-ΔΔCT法进行数据分析。

1.2.5 Western blot Control组取6只大鼠的坐骨神经（n=6）作为所有时间点的阴性对照。3组共66只大鼠在相应时间点腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后处死，提取坐骨神经，匀浆，超声粉碎，4500 g离心10 min后取上清。采用Bradford法绘制标准曲线，测定蛋白浓度，并计算上样量。蛋白样品与缓冲液混合后，95℃水浴5 min变性，上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转印至PVDF膜。PVDF膜经含5%脱脂奶粉的TBST封闭液37℃封闭2 h，加入兔抗Claudin-1抗体（1∶1000稀释），4℃孵育过夜。TBST洗膜10 min×3次，加入HRP标记羊抗兔IgG抗体（1:2000稀释），室温孵育2 h；使用Lumi-Light荧光试剂盒显影并扫描测定Claudin-1蛋白光密度值。TBST洗膜后加入β-actin抗体（1∶25000稀释），室温孵育1 h后，再次使用Lumi-Light荧光试剂盒显影并扫描测定β-actin蛋白光密度值。

1.2.6 免疫荧光染色3组共18只大鼠（n=6）术后1 d经10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后处死，提取坐骨神经。冰冻切片机制作坐骨神经的横断切片，片厚10µm。标本用3%BSA和1%羊血清封闭后，兔抗Claudin-1抗体1∶100稀释后4℃孵育过夜，使用1∶500稀释的Alexa Fluor 594结合羊抗兔IgG二抗常温孵育60 min，再用DAPI行核染色10 min后，共聚焦显微镜下拍照。每只大鼠各选取1张图片，采用Image J软件测定神经内Claudin-1蛋白阳性表达的综合密度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件进行分析。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析或双因素方差分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠机械性触诱发痛阈值变化

与Control组和Sham组相比，CCI组大鼠术后1 d右侧后肢机械痛阈值降低，术后7 d降至最低，并且一直持续到术后14 d（均P＜0.05），见图1。

注：与Control组比较，①P＜0.05，与Sham组比较，②P＜0.05

2.2 BNB渗透性变化

CCI组术后1 d，坐骨神经EBA染色，显微镜下观察发现3组大鼠的坐骨神经外膜结构完整，EBA染色连续均匀，Control组和Sham组的EBA集中在神经外膜，未穿透BNB；CCI组的EBA穿过BNB，渗透入神经内部，见图2。灰度值定量分析结果显示，Control组和Sham组大鼠坐骨神经内EBA含量接近于零，CCI组EBA含量显著增高（P＜0.05），见图2。

2.3 坐骨神经内Claudin-1表达水平变化

RT-PCR测量结果显示，术后6 h、1 d、7 d和14 d CCI组大鼠坐骨神经内Claudin-1 mRNA转录水平显著低于其他2组（均P＜0.05），且术后1 d下降幅度最为明显，见图3A。Western Blot检测结果显示，术后1 d、7 d和14 d，CCI组大鼠坐骨神经内Claudin-1蛋白表达水平显著低于其他2组（均P＜0.05），见图3B。

显微镜下观察坐骨神经切片，可见神经束膜和神经内膜较为完整，未见明显破损。坐骨神经免疫荧光染色显示，Claudin-1蛋白主要分布于神经内膜和神经束膜，见图3C；CCI组坐骨神经损伤后1 d，神经束膜中Claudin-1蛋白荧光强度明显下降，低于其他2组（均P＜0.05），见图3D。

3 讨论

本研究采用丝线结扎法制作CCI模型，结果显示CCI组大鼠术后1 d右侧后肢机械痛阈值降低，术后7 d降至最低，并且一直持续到术后14 d，造模成功。

外周神经被神经外膜、神经束膜和神经内膜包绕。神经外膜包绕在最外层，位于第2层的神经束膜将神经纤维分隔成束，并向内延续形成神经内膜。神经束膜和神经内膜组成BNB，将外周神经与周围组织隔离，维护外周神经内环境稳定、保护神经纤维[5]。在一些病理状态下（如糖尿病神经病变、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化等），BNB通透性常常被改变，神经内环境稳态失衡[6,7]。小鼠在坐骨神经挤压损伤后，BNB通透性增加，屏障功能减弱[2]；CCI大鼠术后3 h即出现BNB通透性增加，且作用可持续至术后2月[8]。这些研究结果均提示，神经损伤引起的慢性疼痛中，BNB的通透性增加。

Lim KT等[3]首次发现BNB通透性的变化直接影响到疼痛的发展：坐骨神经部分结扎后，局部的巨噬细胞通过释放血管内皮生长因子降低紧密连接蛋白ZO-1的表达，从而增加BNB的通透性；受损的坐骨神经中纤维蛋白原及炎性因子释放增加，如白细胞介素（interleukin，IL）-1α，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-β。这些致痛物质穿过通透性增加的BNB，作用于外周神经降低痛阈值，激活或者刺激细胞导致慢性疼痛状态。本研究同样发现大鼠在接受CCI手术后，虽然神经束膜外观正常，但是能够渗透进入坐骨神经内的EBA显著增加，证明BNB完整性被破坏，通透性明显增加。

图2大鼠坐骨神经内EBA含量

图3大鼠坐骨神经Claudin-1表达水平变化

BNB的主要结构由多种紧密连接蛋白（Occludin、Claudin、tricellulin等）及紧密连接的骨架蛋白ZO等组成[9]，其 中Claudin-1起 关 键 作 用。Claudin-1不 仅 是BNB的重要组成部分，同时也是中枢神经系统血脑屏障的重要组成部分，对维护整个神经系统内环境稳定起到了至关重要的作用。研究发现神经周围局部注射高渗盐水（10%氯化钠）[10]或重组纤溶酶原激活剂[4]，能够降低神经内Claudin-1表达水平，增加BNB通透性。Reinhold等[7]发现小鼠在CCI术后7 d时坐骨神经内Claudin-1蛋白下调。本研究进一步揭示了神经病理性疼痛中Claudin-1的变化趋势，结果表明CCI大鼠术后6 h时，Claudin-1的mRNA转录水平开始下降，术后1 d时，Claudin-1蛋白表达水平开始下降，一直持续到术后14 d。这提示，Claudin-1调节BNB通透性可能是神经病理性疼痛的发生发展中的重要环节。

本课题深入观察外周神经受损后BNB通透性及紧密连接蛋白Claudin-1的变化，提示BNB在神经病理性疼痛发生发展机制中的发挥重要作用，其通透性改变可能促进炎症因子进入神经内部，从而导致疼痛的产生，但其具体调节机制尚需进一步研究。降低神经屏障的通透性可能会减少神经内部的炎症因子，从而减缓或者抑制慢性疼痛的发生发展，这将是疼痛治疗的新靶点。