天麻钩藤饮对脑缺血模型大鼠皮层组织中Nrf2／HO-1信号通路的影响

王艳旭 ，李世举 ，钟晓勇 ，梁 晖 ，刘建忠

（1.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003）

脑梗死是导致全球人口死亡的三大疾病之一，具有高发病率、高病死率及高致残率的特点，不仅严重危害人民的健康和生活质量，同时也给患者及其家庭和国家带来沉重的医疗、经济和社会负担。目前治疗脑梗死最有效的方法是血管再通治疗［1］，但血管再通后存在缺血再灌注损伤，该过程引发氧自由基损伤、钙离子内流等病理过程，往往会加重脑梗死并引发一系列脑梗死后遗症，因此各类神经保护制剂的研发及应用一直是临床研究的热点［2-6］，而中医药因其多靶点、多途径等优势在治疗缺血再灌注损伤方面发挥着重要作用，也受到越来越多关注［5］。本课题组前期研究表明，天麻钩藤饮具有抗氧化作用，它不仅能升高谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（CAT）水平，清除过多的氧自由基，还能降低丙二醛（MDA）、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）水平，减轻脑梗死后的氧化应激反应［7-8］，但其具体抗氧化分子作用机制仍需进一步阐明。核因子E2相关因子2（Nrf2）／血红素加氧酶1（HO-1）信号通路是内源性抗氧化应激的重要途径，Nrf2／HO-1信号通路的激活可以减轻脑缺血再灌注损伤，有利于脑缺血神经细胞功能的恢复［4，9］。 因此本研究拟从 Nrf2 ／HO-1 信号通路探讨天麻钩藤饮治疗急性脑梗死的分子机制，以期为该方剂在临床推广应用奠定扎实的理论基础。

1 实验材料

1.1 实验动物 选择SPF级雄性SD大鼠40只，体质量（300±20）g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，恒温恒湿，饲养于福建中医药大学动物实验中心。

1.2 实验药物 天麻钩藤饮组方：天麻9 g，钩藤（后下）12 g，石决明（先煎）20 g，山栀子 9 g，黄芩 9 g，川牛膝 15 g，杜仲 15 g，益母草 15 g，桑寄生 15 g，夜交藤15 g，茯神12 g，炙甘草3 g。由福建中医药大学附属人民医院中药房制备，最终药物浓度为3 g／mL。

1.3 实验试剂和仪器 全反式维甲酸（美国Sigma公司）；AB204-N 电子天平（梅特勒公司）；HO-1、Nrf2兔抗人多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；β-actin（美国CST公司）；BH-2系统显微镜（日本OLYMPUS公司）；PCR仪、Gel DOC 2000凝胶成像系统、APC 300电泳仪、水平电泳槽（美国BioRad公司）。

2 实验方法

2.1 分组和造模 采用随机数字表法将40只SD大鼠分为假手术组、模型组、天麻钩藤饮组、阻断剂组，每组10只。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型。具体方法如下：应用10%水合氯醛按0.35 g／kg腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后固定于定位仪上，切开右侧颈部皮肤，分离并在根部结扎颈外动脉，从右侧颈总动脉分叉下方约3～4 mm处剪一“V”型小口，将3 cm尼龙线插入，当有阻力时停止插入，此时尼龙线进入颈内动脉约为18 mm，待缺血90 min后拨出线栓再灌注，固定尼龙线并缝合皮肤。大鼠造模苏醒后出现以下现象说明模型制备成功：缺血对侧前爪不能伸直，出现转圈现象，行走时身体向偏瘫侧倾倒。假手术组将正常SD大鼠麻醉后固定于定位仪上，切开右侧颈部皮肤，只分离、暴露血管，不结扎颈外动脉，不插入尼龙线，缝合皮肤。

2.2 干预 天麻钩藤饮组自造模成功后3 h内开始灌服天麻钩藤饮混悬液15 g／（kg·d），每日2次。阻断剂组在天麻钩藤饮灌胃的基础上（方式同天麻钩藤饮组），腹腔注射全反式维甲酸［30 mg／（kg·d），溶于二甲基亚砜中］，每日2次。假手术组和模型组于同一时间点开始灌服生理盐水，每次1 mL，每日2次。4组均连续灌服3 d。

2.3 神经功能评分 造模后及术后每天均采用盲法记录神经功能缺损评分，评分标准按Zea Longa的五级4分法标准［10］，0分：无神经功能缺损症状；1分：轻微神经功能缺损，不能完全伸展对侧前爪；2分：中度局灶性神经功能缺损，向对侧转圈；3分：重度局灶性神经功能缺损，行走时向对侧倾倒；4分：不能自行行走或昏迷。动物苏醒后评分在1～4分者为有效模型，评分＜1者或在取脑时发现颅内有血块和Willis环有血栓者予以剔除。

2.4 HE染色 将大鼠脑组织用多聚甲醛灌注后固定48 h，常规石蜡包埋后切片，依次脱蜡、脱水、苏木素及伊红染色，脱水后透明中性树胶封片，置于显微镜下观察脑组织病理形态学变化。

2.5 RT-PCR检测脑梗死侧皮层组织Nrf2、HO-1mRNA水平 大鼠麻醉后断头处死，在冰盘上快速取出脑组织，按TRIZOL试剂盒说明的步骤提取总RNA，通过紫外分光光度计测定RNA浓度，电泳查看RNA的完整性。按照反转录试剂盒合成cDNA。Nrf2 上游引物：5’-AACGCTACGACGTGGAGACAG A-3’，下游引物：5’-GTCATGCATTCCACACTGTCC AGA-3’；HO-1 上游引物：5’-AGGTGCACATCCGT GCAGAG-3’，下游引物：5’-CTTCCAGGGCCGTATA GATATGGTA-3’。将制备好的cDNA进行PCR扩增。使用荧光定量PCR仪采集数据，进行PCR定量分析。

2.6 Western blot检测脑梗死侧皮层组织 Nrf2、HO-1蛋白表达 超声破碎含脑组织的lysis缓冲液，离心取上清液，进行蛋白浓度的测定。取50 ug蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，洗膜，5%无脂牛奶封闭，以及一抗、二抗的孵育，显影。扫描。Image J图像分析软件行图像分析。

2.7 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件处理数据。计量资料符合正态分布的以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析检验，组间两两比较采用LSD-t检验。

3 结 果

3.1 4组大鼠神经功能评分比较 模型组神经功能评分较假手术组显著升高（P＜0.05）。天麻钩藤饮组治疗可以降低神经功能评分（P＜0.05），而阻断剂组可以逆转天麻钩藤降低神经功能评分的作用（P＜0.05），见图 1。

图1 4组大鼠神经功能评分比较

3.2 大鼠皮质病理形态观察 假手术组可见神经元胞体较大，多角形（多个突起），核着色浅，胞质可见特征性结构尼氏体。而模型组神经元皱缩，胞质结构不清，胞浆嗜依红染色增强，尼氏体边聚或消失，核固缩，有的胞体变形缩小，呈三角形，细胞周围间隙增宽。天麻钩藤饮可以在一定程度上减轻缺血再灌注所致的病理损伤，而阻断剂组则会阻断天麻钩藤饮的治疗作用，见图2。

图2 4组大鼠梗死侧皮质HE染色图（×20）

3.3 4组皮层组织中Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达水平的影响 天麻钩藤饮能够上调大脑皮层组织中Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达水平（P＜0.05），而应用Nrf2／HO-1通路阻断剂（全反式维甲酸）则会阻断天麻钩藤饮的上调作用（P＜0.05），见图3、图4。

图 3 4组大鼠梗死侧皮质Nrf2、HO-1 mRNA表达比较

图 4 4组大鼠梗死侧皮质Nrf2、HO-1蛋白表达比较

4 讨论

脑梗死发生时，梗死区域脑组织自由基和其他有害化学基团迅速增多，导致线粒体功能障碍，加重兴奋毒性，促进脂质、蛋白质和DNA过氧化损伤和炎症反应等［11］。因此，氧化应激被认为是脑损伤的基本机制。核转录因子Nrf2信号通路是目前发现的细胞抗氧化应答的核心途径之一，能够显著诱导机体的内源性抗氧化应答。Nrf2信号通路的缺失或激活障碍，会加重氧化应激状态、破坏细胞内正常的氧化还原平衡稳态，导致细胞功能障碍、凋亡，甚至死亡。研究表明，缺血脑组织Nrf2表达显著上调，多种Nrf2诱导剂在脑缺血后均具有神经保护作用［4］。在大鼠局灶性脑缺血模型研究中发现，Nrf2表达水平上调，同时出现脑梗死体积缩小、脑水肿减轻和神经功能改善，其作用机制可能是通过上调Nrf2，诱导其下游抗氧化酶和解毒酶的表达，从而发挥抗氧化作用［9］。HO-1亦称热休克蛋白、是一种拮抗氧化应激的抗氧化酶，是Nrf2调控的下游目的基因，近年来，HO-1的神经系统保护作用越来越受到重视，因为它能通过产生CO和胆红素发挥脑损伤的抗氧化保护作用。HO-1／胆红素／CO共同组成了机体不可缺少的内源性保护系统，广泛参与抗炎与多种急慢性氧化应激损伤，在防止高血压、动脉粥样硬化、哮喘等多种疾病中起重要作用［12］。综上，Nrf2／HO-1信号通路是内源性抗氧化应激的重要途径，调控Nrf2／HO-1信号通路的表达具有神经保护作用。

天麻钩藤饮源自《杂病证治新义》，方中天麻、钩藤为君药，平肝熄风；石决明为臣药，与君药合用，加强平肝熄风之力；杜仲、桑寄生以补益肝肾，以固其本；黄芩、栀子清热泻火，泻肝经之热；夜交藤、茯神以宁心安神；川牛膝引血下行，益母草活血利水，体现“治风先治血，血行风自灭”之理。诸药配伍，共奏平肝熄风、清热活血、补益肝肾之功效。

本研究结果显示，天麻钩藤饮可以降低脑缺血大鼠的神经功能评分（P＜0.05），提示天麻钩藤饮可以改善脑缺血大鼠的神经功能。同时天麻钩藤饮可以减轻缺血再灌注损伤所致的病理改变，其具体分子作用机制可能与激活了Nrf2／HO-1信号通路有关。此外，巩敏杰等［13］研究表明，Nrf2表达在脑梗死后呈一个动态变化的过程，梗死后1～2 d脑组织Nrf2表达升高，在第3天左右下降。该结论和本研究结果一致，模型组第3天Nrf2的表达水平与假手术组无差异，而HO-1的高表达持续至第3天；但和模型组比较，在第3天天麻钩藤饮可以进一步上调Nrf2及HO-1的表达，提示在脑梗死急性期天麻钩藤饮可能通过持续激活Nrf2／HO-1信号通路而起到保护神经细胞的作用，进而促进神经功能的康复，但其具体作用机制仍需进一步阐明。