云南地区肿瘤患者CRE菌株的表型筛选与耐药基因相关性研究*

杨晓芳，杜 艳，杨 伟，张 曦

1.云南省肿瘤医院检验科，云南昆明 650118;2.昆明医科大学第一附属医院检验科，云南昆明 650118

碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)临床治疗失败率高，病死率高，严重威胁患者健康。CRE耐药机制最常见的是产碳青霉烯酶，2017年美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐采用改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)检测碳青霉烯酶，但是其不能区分酶的类型，2018年CLSI又加入了乙二胺四乙酸(EDTA)碳青霉烯类灭活试验(eCIM)，与mCIM联合，用于区分肠杆菌科中产金属酶和丝氨酸碳青霉烯酶的菌株[1]，这对于临床用药有非常重要的指导意义。用药习惯的不同使不同时期、不同地域CRE的临床感染特点和耐药性各有差异，肿瘤患者是CRE的易感人群，一旦发生CRE感染，后果十分严重。有研究显示，肿瘤医院耐药菌的检出率高于综合性医院[2]，还有研究发现,使用了大剂量化疗药物的患者,长期应用广谱抗菌药物后,其医院感染率高达20%，说明肿瘤患者的耐药情况有别于一般患者[3]。本研究选取云南省肿瘤医院肿瘤患者分离的CRE菌株，进行mCIM与eCIM表型筛选，并与耐药基因进行比较，明确表型筛选试验在肿瘤患者当中的临床适用度，为CRE院内感染的防控和优化临床用药提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2015年1月至2018年12月云南省肿瘤医院临床科室送检的31株CRE，菌株采用法国生物梅里埃公司生产的全自动微生物鉴定与药敏分析系统VITEK-2及其配套的GN卡、AST-GN14卡进行检测，分离出至少对亚胺培南(IPM)、美罗培南或厄他培南中的一种耐药的肠杆菌科细菌，定义为CRE。收集到的31株菌株分离提纯后纸片法留菌冻存于-80 ℃冰箱。质控菌株：肺炎克雷伯菌ATCCBAA1705、ATCCBAA1706、ATCCBAA2146。

1.2试剂与仪器 美罗培南药敏纸片购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；TSB干粉购自杭州滨和微生物试剂有限公司；PCR所用试剂、琼脂糖、5×TBE、DNA分子量标准、凝胶染色试剂(GelRed)、引物均购自上海生工生物工程有限公司；乙二胺四乙酸二钾购自上海试剂一厂；哥伦比亚血琼脂平板、MH琼脂平板购自郑州安图生物工程股份有限公司；Vitek-2全自动微生物鉴定与药敏分析仪购自法国生物梅里埃公司；恒温金属浴(HB120-S)购自大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；实时荧光定量PCR仪(ViiA7 Dx)购自美国ABI公司；电泳仪(power pac200)购自美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1菌种复苏 取出冻存于-80 ℃冰箱中的细菌恢复至室温，用无菌镊子夹取适量沾有细菌的纸片分区划线接种于血琼脂平板，平板上做好标记后放于37 ℃孵箱中孵育18～20 h。

1.3.2mCIM与eCIM联合检测 31株菌株均进行mCIM与eCIM联合检测，操作及结果判读严格按照2018年CLSI-M100文件执行[1]。

1.3.3碳青霉烯酶基因检测 煮沸法提取细菌DNA模板，PCR扩增碳青霉烯酶类耐药基因，包括blaKPC-2、blaSME、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48共6种[4]，见表1。PCR 扩增体系为25 μL：2×Tap PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L )各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件为:95 ℃预变性5 min(blaKPC-2为94 ℃ 3 min，blaIMP和 blaVIM为94 ℃ 5 min)； 94 ℃变性45 s(blaNDM-1为94 ℃ 30 s)，55 ℃退火45 s(blaKPC-2为56 ℃ 45 s，blaNDM-1为63 ℃ 30 s，blaIMP为53 ℃ 45 s)，72 ℃延伸1 min(blaNDM-1为72 ℃ 45 s)，30个循坏；72 ℃终延伸 10 min(blaNDM-1为72 ℃ 3 min)。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，紫外凝胶成像仪观察结果。

表1 碳青霉烯酶基因PCR扩增引物序列

1.4统计学处理 应用SPSS17.0软件处理数据，计数资料以率表示，采用χ2检验。以PCR结果为“金标准”，计算 mCIM和eCIM检测的灵敏度和特异度，并分别与基因检测结果进行一致性分析，其中Kappa 0.0～0.20为极低一致，>0.20～0.40为一般一致；>0.40～0.60为中等一致，>0.60～0.80为高度一致，>0.80～1.00为几乎完全一致。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1菌株信息 云南省肿瘤医院CRE菌株以肺炎克雷伯菌(15株，占48.4%)为主，其次依次为大肠埃希菌7株，阴沟肠杆菌3株，产酸克雷伯菌和弗氏柠檬酸杆菌各2株,产气肠杆菌和克氏柠檬酸杆菌各1株。31株CRE分离自8种不同类型的标本，其中尿液12例，体液9例，痰3例，血2例，咽拭子2例，脑脊液、分泌物、引流液各1例，其中尿液标本所占比例最高(38.7%)。感染年龄多集中在中老年人群，40岁以下患者仅1例(3.2%)，60岁以上患者14例(45.2%)。科室分布主要集中在外科，其中重症医学科7株,泌尿外科7株,神经外科5株，腹部外科5株，结直肠外科2株，放射治疗科、姑息医学科、骨科、微创介入科、胸外科各1株。直肠癌、膀胱癌、颅内肿瘤是分离CRE最多的3种肿瘤类型。

2.2mCIM与eCIM检测 31株CRE中，mCIM检测阳性27株(87.1%)，eCIM检测阳性20株(64.5%)，不解释的有4株(12.9%)。mCIM和eCIM联合检测判断为丝氨酸碳青霉烯酶7株(22.6%)，金属酶20株(64.5%)，碳青霉烯酶阴性4株(12.9%)。

2.3耐药基因检测情况 31株CRE菌株中，26株检出碳青霉烯酶耐药基因，阳性率为83.9%。31株CRE菌株包括11株blaKPC-2基因(阳性率35.5%),12株blaNDM-1基因(阳性率38.7%),2株blaIMP基因(阳性率6.5%)，1株同时扩增出blaKPC-2和blaNDM-1基因(3.2%)，5株未扩增出6种耐药基因(16.1%)，blaSME、blaVIM、blaOXA-48 3种耐药基因经PCR检测均为阴性。肺炎克雷伯菌以blaKPC-2基因型为主(10株)，占肺炎克雷伯菌的66.7%;大肠埃希菌以blaNDM-1基因型为主(5株)，占大肠埃希菌的71.4%。

2.4mCIM、eCIM表型筛选与耐药基因的相关性 26株碳青霉烯酶基因阳性菌株中，mCIM 检测全部为阳性。以PCR检测结果为“金标准”，mCIM检测碳青霉烯酶的灵敏度和特异度分别为100.0%、80.0%，与PCR检测的一致性程度为“几乎完全一致”(Kappa=0.870，P<0.001)；eCIM检测金属酶的灵敏度和特异度分别为100.0%、53.8%，与PCR检测的一致性程度为“中等一致”(Kappa=0.518，P<0.001)；mCIM联合eCIM检测碳青霉烯酶总的灵敏度和特异度分别为73.1%、80.0%，检测丝氨酸碳青霉烯酶的灵敏度为50.0%，检测金属酶的灵敏度为100.0%，与PCR检测的一致性程度为“高度一致”(Kappa=0.624，P<0.001)。有1株弗氏柠檬酸杆菌耐药基因检测为阴性，但mCIM为阳性。1株同时含有 KPC-2和NDM-1基因型的菌株mCIM为阳性，eCIM 为阴性。有6株基因型为KPC-2的肺炎克雷伯菌eCIM检测为阳性。见表2、3。

表2 31株CRE碳青霉烯酶基因检测和mCIM、eCIM结果分布(n)

表3 mCIM联合eCIM与PCR检测结果判读的比较(n)

3 讨 论

近30年来，CRE流行足迹已遍布美洲、欧洲、亚洲、非洲等多个国家和地区，在我国，CRE的流行情况同样十分严峻。全国细菌耐药监测网(1 307家医院)数据显示CRE的检出率逐年上升，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌检出率从2013年的4.9%上升至2017年的9.0%，且CRE检出呈现地域性差异，2017年CRE检出率在上海市和河南省高达25.0%以上[5]。可见，CRE 菌株的迅速蔓延是国内外共同面临的严峻挑战。

美国9个实验室对mCIM进行评估，表明其检测碳青霉烯酶的灵敏度和特异度均达到90%以上[6]。本研究mCIM检测的阳性率为87.1%，检测碳青霉烯酶的灵敏度达到了100.0%，与相关文献研究结果一致[6-10]，但特异度低于有关文献的报道[6，8，11-13]。mCIM与PCR检测的一致性程度为“几乎完全一致”(Kappa=0.870，P<0.001)，与马玉兰等[8]报道的一致性程度相符(Kappa=0.851)。本研究mCIM特异度偏低，推测可能的原因为：(1)菌株总数及基因阴性菌株数量较少，存在标本数量的差异性。(2)PCR扩增只能对已知的编码基因进行检测，若该菌株存在少见或未知的耐药基因则会导致碳青霉烯酶基因检测结果呈假阴性。TAMMA等[14]对11种碳青霉烯酶表型筛选方法针对产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的筛选能力进行了比较，研究表明mCIM试验对KPC、NDM、IMP基因型的灵敏度分别为98%、100%、83%。ZHOU等[15]研究报道显示，mCIM检测的灵敏度均>98%，而本研究中3种基因型的灵敏度均为100%，说明mCIM对于肿瘤患者KPC、NDM、IMP基因型也具有较高的灵敏度。

本研究结果显示，eCIM对于KPC-2基因型的鉴别能力不足，容易出现假阳性结果，应引起重视。虽然张凡等[9]、马玉兰等[10]的研究中也发现KPC-2基因型为阳性同时eCIM 也为阳性的菌株。笔者查阅文献推测可能的原因为：(1)菌株间存在地区差异性及肿瘤患者自身用药问题；(2)eCIM本身方法学问题：①EDTA 对细菌生长也有一定抑制作用，可能通过增强细胞膜的通透性导致对抗菌药物敏感；②EDTA 对少量丝氨酸碳青霉烯酶，如 KPC、OXA-48 等，也存在抑制现象，会导致假阳性。但EDTA对细菌生长的抑制作用对eCIM结果影响有多大及多少剂量的EDTA可以引起假阳性结果还有待后续实验进一步证实。本研究有1株同时含有KPC-2和NDM-1基因型的菌株eCIM为阴性，马玉兰等[10]的研究也发现3株同时含有KPC-2和 NDM-1基因型的菌株eCIM为阴性，这与相关研究结果一致[1]，eCIM阴性结果不能排除金属酶的可能性，菌株可能同时含有2种耐药基因。

通过Kappa一致性比较分析发现，mCIM、eCIM在云南地区肿瘤患者中与耐药基因有高度的一致性，联合检测能同时区分碳青霉烯酶的类型，且该方法操作简便，不需要特殊仪器，成本低廉，值得推广使用。

本研究肺炎克雷伯菌以blaKPC-2基因型为主，大肠埃希菌以blaNDM-1基因型为主。查阅文献发现，对耐碳青霉烯酶的大肠埃希菌的研究报道较少，本研究虽然大肠埃希菌只有7株，却发现5株均为blaNDM-1基因型，故本研究对于临床用药有指导意义，提示可以根据检出菌的种类来指导用药，如果为大肠埃希菌，可优先考虑对金属酶有效的药物，新型抗菌药物头孢他啶/阿维巴坦可能无效，同时应提高对此类菌的院内感染监测，防止耐药菌的传播。

本研究中老年人更易感染CRE，老年患者由于脏器功能减退及自身免疫力下降，是感染的高危人群，在CRE的防治中应重点关注老年人。本研究CRE分布最多的科室是重症医学科，这与重症医学科患者大多感染重及脏器功能弱有关。本研究中尿液标本所占比例最大，可能因为部分肿瘤患者长期留置导尿管，增加了病原菌的感染机会，所以在临床诊治过程中应注意及时更换或者拔除尿管，减少不必要的有创操作，以免引起多重耐药菌的感染。