IBD患病人群肠道菌群分布特征及其与血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的关系

李冬盎，马晓芬，曲湉湉，李 欢

海军第九七一医院检验科，山东青岛 266102

炎症性肠病(IBD)是一组包括溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)在内的肠道慢性炎症性疾病，患者主要临床表现为反复发作的腹胀、腹痛、腹泻、大便异常(黏液稀便、黏液脓便、脓血便、血水样便等)及发热，部分患者还会出现关节炎、皮疹等各种肠外表现[1]。当前，我国IBD患者数量不断增加，发病率逐渐升高，严重影响患者的生活质量。IBD的病因目前尚不清楚，绝大多数学者认为其可能与遗传、免疫、环境、肠道微生态等因素密切相关，尤其是肠道微生态紊乱的临床表现及相关作用机制逐渐受到越来越多学者的关注[2-3]。无论是国内还是国外都建议在治疗IBD时根据患者整体病情变化，尤其是病变累及部位和病情严重程度采用个体化治疗方案，但目前临床上所应用的评估患者疾病活动性的治疗均存在一定局限性[4]。免疫炎症相关蛋白复合物(IIRPCs)是存在于人体血清中的一种与机体炎症、免疫和补体系统有关的蛋白质，参与机体系统发现、细菌清除及肠道免疫的稳态[5]。髓过氧化酶(MPO)是一类存在于中性粒细胞中与细胞浸润程度有关的酶，在评价组织中性粒细胞的浸润程度和炎症发生方面发挥着重要作用。研究发现，MPO活性变化能通过对中性粒细胞浸润情况的调节来改变结肠炎患者炎性反应情况和临床症状，可用于结肠炎等感染性疾病、肠道有关疾病的诊断、病情评估、治疗效果及预后评价[6]。维生素D1-α羟化酶(CYP27B1)是循环形式维生素D转化为有活性的1,25二羟基维生素D3(1,25-OH2-D3)过程中的关键酶，而维生素D的缺乏也被指出与免疫相关疾病发生、发展有关，这其中就包括IBD[7]。本文探讨IBD患病人群肠道菌群分布特征与血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的变化，并进一步对二者的相关性进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年7月至2020年4月在本院消化科门诊和住院治疗的106例IBD患者作为病例组，其中UC患者58例作为UC组，CD患者48例作为CD组；选取同期在本院接受治疗的60例非IBD肠道疾病患者作为疾病对照组；另选取在本院同期进行结肠镜检查的60例体检健康者作为健康对照组。病例组纳入标准：(1)符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012，广州)》的诊断标准[8]；(2)年龄18～60周岁；(3)经临床表现、影像学检查、组织病理检查、内镜检查、实验室检查等均确诊。病例组排除标准：(1)近期患有上消化道糜烂、溃疡或感染性胃肠病；(2)30 d内服用非甾体类抗炎药、益生菌制剂、他汀类、维生素D制剂等药物；(3)合并免疫系统相关疾病；(4)合并严重肝肾功能障碍、原发性甲状腺功能亢进等可能引起严重维生素D代谢紊乱的相关疾病；(5)有肠道手术史；(6)无法行全结肠镜检查。疾病对照组患者就诊时均表现出不同程度的腹痛、发热、腹泻等，经结肠镜检查排除IBD。健康对照组研究对象均经病史询问和体格检查无消化道相关疾病，无自身免疫病史、其他系统恶性肿瘤病史，近期未使用可能影响本研究结果的相关药物。病例组中男72例，女34例；年龄20～58岁，平均(42.29±5.93)岁；其中缓解期组32例，活动期组74例，活动期组包括轻度活动期组21例，中度活动期组32例，重度活动期组21例。疾病对照组中男43例，女17例；年龄18～60岁，平均(41.06±7.92)岁；其中小肠炎症16例，小肠溃疡19例，慢性结肠炎20例，结肠癌5例。健康对照组中男41例，女19例；年龄18～56岁，平均(40.94±7.15)岁。各组研究对象年龄、性别等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核通过，患者和(或)家属均知情，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1资料收集 收集所有研究对象的相关临床资料，包括基本信息、诊断、疾病活动性评估、实验室检查结果、结肠镜检查结果等。UC患者疾病活动性评估应用改良Mayo评分评价[9]，评分≤2分且每个单项评分均超过1分为缓解期，否则为活动期，其中>2～5分为轻度活动期，>5～10分为中度活动期，>10～12分为重度活动期。CD患者疾病活动性评估应用Harvey-Bradshaw指数评价[10]，评分≤4分为缓解期，>4分为活动期，其中>4～8分为中度活动期，>8分为重度活动期。

1.2.2标本采集与储存 采集所有受试者结肠镜检查当天的空腹血液标本和新鲜粪便标本5～10 g，血液标本于4 ℃下3 000 r/min离心10 min后采集上层血清，置于-80 ℃冰箱中保存待测；新鲜粪便标本置于无菌密闭的便盒中，常温下0.5 h内送检。

1.2.3血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平检测 取保存的血清标本，应用Native-PAGE电泳方法进行血清蛋白电泳，以人血清转铁蛋白相关蛋白复合物水平对IIRPCs、CYP27B1水平进行相对定量，应用Umax Powerlook 2100XL Scanner凝胶扫描仪进行凝胶扫描，应用美国Bio-Rad公司的Quantity One 软件计算标本中的IIRPCs和CYP27B1的水平；采用乳胶增强免疫比浊法检测血清MPO水平，在日立7180全自动生化分析仪上进行检测，MPO试剂盒购自北京九强生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.2.4肠道菌群检测 取0.5 g新鲜粪便标本，10倍法稀释。选择肠球菌、肠杆菌、消化球菌、拟杆菌、酵母菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、真杆菌进行培养、鉴定和检测，选择相应的培养基进行培养。采用需氧培养基培养肠球菌、肠杆菌和酵母菌，采用厌氧菌培养基对其他细菌进行培养，培养温度均为37 ℃，时间分别为24 h和72 h。细菌鉴定应用法国生物梅里埃公司的半自动微生物鉴定系统，用每克粪便中含有菌数的log CFU/g表示菌落数量。

2 结 果

2.1各组研究对象肠道菌群数量比较 UC、CD组患者的肠道肠球菌、肠杆菌、消化球菌、拟杆菌、酵母菌数量较健康对照组和疾病对照组均明显增加，而乳酸杆菌、双歧杆菌、真杆菌则明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。UC组和CD组肠道各菌群数量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。106例IBD患者中，缓解期与活动期患者上述肠道菌群数量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。重度活动期患者与轻度、中度活动期患者比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，轻度活动期患者与中度活动期患者比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1、2。

表1 UC组、CD组、健康对照组、疾病对照组肠道菌群数量比较

表2 IBD患者缓解期组、轻度活动组、中度活动组、重度活动组肠道菌群数量比较

2.2各组研究对象血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比较 UC、CD组血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平均明显高于健康对照组和疾病对照组(P<0.05)。UC组与CU组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。106例IBD患者中，缓解期与活动期IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；重度活动期患者与轻度、中度活动期患者血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；轻度活动期组患者与中度活动期组患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、4。

表3 UC组、CD组、健康对照组、疾病对照组血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比较

表4 IBD患者缓解期组、轻度活动组、中度活动组、重度活动组血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比较

2.3IBD患者肠道菌群数量与血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的相关性分析 Pearson相关性分析显示，IBD患者的血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平与肠道肠球菌、肠杆菌、拟杆菌、酵母菌数量呈正相关(P<0.05)，与乳酸杆菌、双歧杆菌数量呈负相关(P<0.05)，与真杆菌和消化球菌数量无相关性(P>0.05)。见表5。

表5 IBD患者肠道菌群数量与血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的相关性分析

3 讨 论

肠道菌群是IBD发病机制研究的一个重要内容。研究指出，人体的肠道中含有数量巨大的可影响肠黏膜免疫系统功能的细菌，其能使有IBD遗传易感性个体的肠道免疫反应发生异常，进而可能诱发IBD[2]。肠道菌群包含中性菌、有害菌和益生菌，是人体肠道微生态的重要组成部分。不同菌群在正常生理条件下处于一个平衡状态，互相依存和制约，发挥其生物屏障作用。而一旦这种平衡被打破，肠道菌群处于紊乱状态时，就会引起肠道功能异常，继而引发疾病。IBD的发病中，肠道菌群成分的存在不可或缺。有研究对对照组、UC组和CD组的肠道菌群分布情况进行观察发现，UC、CD患者肠道双歧杆菌数量显著减少，消化球菌、真杆菌明显增加[11]。本研究结果显示，UC、CD组患者的肠道肠球菌、肠杆菌、消化球菌、拟杆菌、酵母菌数量较健康对照组和疾病对照组均明显增加，而乳酸杆菌、双歧杆菌、真杆菌则明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；UC组和CD组肠道各菌群数量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示IBD患者存在明显的肠道菌群失调，表现出以乳酸杆菌、双歧杆菌为代表的益生菌数量的减少和以肠球菌、肠杆菌等为代表的条件致病菌数量的增加。进一步比较不同疾病活动性患者的肠道菌群分布显示，缓解期与活动期患者上述肠道菌群数量比较也存在明显差异，其中重度活动期患者与轻度、中度活动期患者比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，轻度活动期患者与中度活动期患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示与其他非IBD肠道疾病患者和健康人群比较，IBD患者存在明显的的肠道微生态失衡，且与其疾病活动性密切相关。肠道微生态紊乱会降低拮抗病原微生物的定植抵抗力，肠道免疫系统无法耐受这种菌群的变化，导致肠黏膜屏障功能受损和肠道通透性改变，位于肠腔中的细菌和产物转移至肠黏膜固有层，黏膜免疫被激活，人体对自身肠腔中的细菌和产物失去耐受，进而导致IBD的发生[12]。

IBD存在很多细胞介导免疫反应异常的现象，包括T淋巴细胞亚群改变和黏膜IgG产生细胞，说明黏膜免疫细胞在收到抗原刺激后聚集和被激活，尤其以辅助性T细胞激活显著，进而引起各种细胞因子分泌和释放，使黏膜炎症产生和加重，导致IBD相关的病理改变。血清中的IIRPCs是很多炎症相关蛋白分子通过非共价键互相作用形成的一包含补体、免疫球蛋白、转铁蛋白、载脂蛋白、触珠蛋白等的蛋白复合物，其与人体的补体、炎症和免疫系统等密切相关。补体系统不仅能帮助机体发现和清除细菌，还有助于维持肠道免疫系统处于稳定的状态。有关儿童IBD的一项研究显示，补体C4水平与患儿炎症水平呈正相关，补体系统对微生物反应程度的增强是导致IBD患者肠道微生态菌群失调的原因之一[13]。MPO是髓细胞的特异性标志物，存在于髓系细胞的嗜苯胺蓝颗粒中，是中性细胞衍生蛋白，当机体受到感染、炎症等刺激时，中性粒细胞及单核细胞就会释放大量的MPO，MPO能将活化信号通过细胞信号通路传递到细胞核内，使机体炎性反应程度增强，并决定细胞浸润情况。MPO在很多感染性疾病的筛查、诊断、病情评估、治疗效果监测与评价中发挥着重要作用。此外，还有学者指出，MPO产生的自由基对小鼠肠道抗氧化能力、炎性反应和肠道菌群结构均会产生影响，其会通过不同作用参与到肠道菌群的调控中[14]。粪便中MPO的检测对IBD的诊断具有较高的辅助临床价值，其存在稳定且易于检测，能较好地反映患者肠道局部病变情况和疾病活动性。有学者研究指出，血清MPO对IBD的辅助诊断也有一定的应用价值，相比粪便标本，血清标本能更好地反映出患者全身的整体情况，但在特异性判断疾病活动性上可能有一定局限性[15]。CYP27B1是将循环形式维生素D转化为有活性的1,25-OH2-D3过程的关键酶，也是维生素D的生物作用形式。研究指出，肠道炎性反应组织中CYP27B1水平会显著升高，其会通过调节循环中的维生素D水平来参与IBD的发生、发展[16]。肠道外周组织和免疫细胞(树突状细胞、巨噬细胞等)中均可见CYP27B1的表达。CYP27B1对结肠黏膜有保护作用，其能通过维持局部组织的维生素D来参与机体的抗炎反应。而维生素D已经被证实能影响机体肠道屏障结构、功能及微生物组成，从而影响肠黏膜和肠道菌群的稳定性[17]。本研究结果显示，UC、CD组血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平均明显高于健康对照组和疾病对照组，缓解期与活动期，以及重度活动期与轻度、中度活动期患者血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，轻度活动期患者与中度活动期患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。相关性分析显示，IBD患者的血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平与肠道肠球菌、肠杆菌、拟杆菌、酵母菌数量呈正相关(P<0.05)，与乳酸杆菌、双歧杆菌数量呈负相关(P<0.05)，提示与其他非IBD肠道疾病患者和健康人群比较，IBD患者血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平均明显升高，其表达与患者疾病活动性有关，而且与肠道菌群也存在一定相关性，血清IIRPCs、MPO、CYP27B1可作为无创性生物标志物用于IBD患者与非IBD肠道疾病患者鉴别诊断及IBD患者病情活动性的评估。但其在IBD发生、发展和患者肠道菌群紊乱中的具体作用和机制还需进一步研究证实。