超高效液相色谱法测定饲料中斑蝥黄和β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯含量方法的研究

章厉劼， 钱莘莘， 孙真峥， 王庆红， 廖 欢， 赵 贵

（贵州省兽药饲料监察所，贵州贵阳 550003）

斑蝥黄又称角黄素、 斑蝥黄质， 化学名称为β，β-胡萝卜素-4，4-二酮（汪洪涛等，2003），存在于某种蘑菇、甲壳类、鱼类、藻类、蛋、血液、肝脏等中，含量极微（凌关庭等，1989），可增加禽皮肤、脚、酮体和蛋的颜色及亮度（王慧文等，2015），应用于鸡饲料中给“三黄鸡”和蛋黄着色（付叔海和刘婷，2017）。 β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯又叫阿朴胡萝卜素酸乙酯或阿朴酯， 是类胡萝卜素中一种含氧的阿朴胡萝卜素类化合物（朱基美，2012），可用于蛋黄和鸡肉皮肤着色，对家禽的皮肤、脚胫和皮下脂肪着色有明显作用（张洪丽，2016）。

但超量使用斑蝥黄， 会造成着色剂在禽蛋中蓄积、残留，被消费者摄入。研究表明，角黄素的高摄入量可能造成色素在视网膜的累积， 从而影响人的视力（田洋等，2012）。1995 年，联合国粮农组织/世界卫生组织的食品添加剂联合专家委员会（JECFA）制定了角黄素可接受的每日摄取最大量可达0.03 mg/kg （按个人体质量计）（李红霞等，2015）。 斑蝥黄和 β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯是我国允许使用的禽饲料添加剂，一般配合使用，并规定斑蝥黄禽蛋饲料限量为8 mg/kg，肉禽饲料限量为 25 mg/kg；β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯和斑蝥黄同时使用时，总量不超过80 mg/kg（中华人民共和国农业部，2017）。

目前，国标检测斑蝥黄主要是液相色谱法—正相法及分光光度法（中华人民共和国农业部，2016；中国人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2002），β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯主要是分光光度法 （中国人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2008），鲜有同时检测饲料中斑蝥黄和β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯的国标方法，普适性差，检测速度慢。 因此，本研究旨在用超高效液相色谱仪建立一种快速、 准确的同时测定饲料中斑蝥黄和β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯的方法，用于开展饲料中着色剂监测， 正确评估禽饲料中着色剂使用情况，确保饲料质量安全。

1 实验材料

1.1 仪器设备 I-Class 超高效液相色谱仪，Waters 公司生产；3K15 高速冷冻离心机，SIGMA 公司生产；MS3 旋涡混匀器，IKA 公司生产；Direct-Q8UV-R 超纯水机， 密理博公司生产；N-EVAP-112 氮吹仪， Organomation 公司生产；KQ-250DE超声波清洗仪，昆山市超声仪器公司生产；XS105电子天平 （万分之一）， 梅特勒公司生产；BT224S电子天平（百分之一），赛多利斯公司生产； ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱 （2.1 mm×100 mm，粒度 1.8 μm），Waters 公司生产。

1.2 试剂和溶液

1.2.1 对照品 斑蝥黄: 批号 1013560， 含量97.50%， 德国 Dr.Ehrenstorfer 公司生产；β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯: 批号 CT190218-10， 含量98.57%，美国斯坦福分析化工有限公司生产。

1.2.2 试剂 甲醇、乙腈，色谱纯；正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、冰乙酸、无水乙醇、甲基叔丁基醚、焦性没食子酸， 分析纯； 实验用水为Direct-Q8UV-R 超纯水机所制超纯水。

1.3 实验样品 从贵州省9 个市饲料企业、养殖场抽取的215 份商品饲料或自配饲料， 按GB/T 20195 进行制备。

2 实验方法

2.1 标准溶液的配制 斑蝥黄储备液：称取斑蝥黄对照品适量，加入0.1 g 焦性没食子酸，用三氯甲烷超声溶解配制成浓度为500 μg/mL 的斑蝥黄标准储备液。

β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯储备液：称取β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯对照品适量，加入0.1 g焦性没食子酸， 用三氯甲烷超声溶解配制成浓度为 500 μg/mL 的 β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯标准储备液。

斑蝥黄中间液：准确量取适量斑蝥黄储备液，用甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）溶液配制成浓度为50 μg/mL 的斑蝥黄中间液。

β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯中间液：准确量取适量β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯储备液，用甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）溶液配制成浓度为100 μg/mL 的 β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯中间液。

工作液： 准确量取适量斑蝥黄、β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯中间液， 用甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）溶液逐级稀释成系列混标工作液。 斑蝥黄浓度为 1.25、2.5、5.0、10 μg/mL；β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯浓度为 2.5、5.0、10、20 μg/mL。

2.2 样品前处理 称取浓缩饲料1 g，配合试样2 g（精确到到0.01 g）于50 mL 离心管中，分别加入水4.0 mL、饱和氯化钠溶液2.0 mL、0.05%乙酸溶液4.0 mL，摇匀，加入提取剂甲醇-乙酸乙酯-正己烷 （V/V/V=1：1：1）10.0 mL， 涡旋 2 min， 然后5000 r/min 离心5 min，用滴管吸取上层萃取液于另一个离心管，重复3 次，合并萃取液后，加入2.0 mL无水乙醇（4.6），于40 ℃下氮气吹干。用甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）5.0 mL 溶解残余物，0.22 μm 微孔滤膜过滤， 上机测定。 以上操作均在通风柜内进行。

2.3 色谱条件 色谱柱为Acquity UPLC HSS T3（1.7 μm，2.1 mm × 100 mm），以乙腈+ 0.1%甲酸水（V/V=1：9）为流动相，等度洗脱色谱条件见表1。

表1 色谱条件

2.4 方法准确度 称取空白试样2.0 g 于50 mL 离心管中， 分别加入斑蝥黄中间液和β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯中间液适量， 配制阳性添加样品，含量见表2。 每个添加量平行制备3份，按2.2 样品前处理方法制备，上机测定，以实测含量与理论添加量计算回收率， 考察方法的准确度，同时计算RSD。

图2 阳性添加样含量 mg/kg

2.5 精密度考察 称取空白试样2.0 g 于50 mL离心管中， 按表2 中A5 的浓度配制阳性添加样品6 份，按2.2 样品前处理方法制备，上机测定，以实测含量计算RSD，考察精密度。

2.6 方法灵敏度考察 在空白试样中添加斑蝥黄和β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯标准中间液，经前处理后用超高效液相色谱仪检测， 依据色谱峰信噪比S/N＞3 为方法的检测限，S/N＞10 为方法的定量限。

2.7 实际样品的检测 应用建立的方法测定215批禽饲料中斑蝥黄和β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯的含量。

3 结果与分析

3.1 光谱图 取混标工作液上机测定，斑蝥黄光谱图见图1，β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯光谱图见图2。

图1 斑蝥黄光谱图

图2 β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯光谱图

3.2 标准曲线的绘制 将斑蝥黄和β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯的混合标准工作液进样， 按峰面积进行线性回归计算，绘制得到标准曲线，斑蝥黄回归方程为 y=37624x+1579，R2=0.99945，见图3；β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯回归方程为y=38255x-1527，R2=0.99968，见图4。斑蝥黄和 β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯线性关系良好。

图3 斑蝥黄标准曲线

图4 β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯标准曲线

3.3 方法准确度考察结果 方法准确度考察结果见表3。斑蝥黄在0.625～10.0 mg/kg 的添加回收率 能 达 到 72.8% ～ 82.8% ，RSD 为 0.41% ～1.06%；β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯在 2.50 ～40.0 mg/kg 的添加回收率能达到72.0% ～82.8%，RSD 为0.46% ～1.41%。 从上述分析结果可以看出，斑蝥黄和β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯在5 个浓度添加水平上的回收率和RSD 均很好，表明该方法准确度高、精密度好。

3.4 精密度考察结果 精密度考察结果见表4。

3.5 方法灵敏度考察结果 测定结果表明，当添加浓度为0.06 mg/kg 时，斑蝥黄及β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯测定的S/N＞3，方法的检测限均为0.06 mg/kg；当添加浓度为0.20 mg/kg 时，斑蝥黄和β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯测定的S/N＞10，方法的定量限均为0.20 mg/kg。

3.6 实际样品的检测结果 检测结果表明，215批禽饲料中斑蝥黄检出92 批，β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯检出59 批，同时检出的56 批。检出饲料中，斑蝥黄含量为 0.128 ～ 8.64 mg/kg；β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯含量为0.888 ～16.3 mg/kg。说明该方法能满足禽饲料中斑蝥黄和β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯含量常规检测要求。

表3 斑蝥黄和β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯回收率与RSD 结果（n=3）

表4 斑蝥黄和β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯RSD 结果（n=6）

4 讨论

4.1 检测波长比较 从光谱图可见斑蝥黄最大吸收为472 nm，β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯最大吸收为445 nm。检测波长选择472 nm 时，同浓度斑蝥黄与β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯灵敏度相当， 检测波长选择445 nm 时， 斑蝥黄灵敏度下降，远低于β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯。 饲料中斑蝥黄含量较低，应提高斑蝥黄的灵敏度，因此选择472 nm 为该方法的测定波长。

4.2 提取溶剂的选择 实验分别取乙腈、乙酸乙酯、三氯甲烷等有机试剂进行提取，提取效果均不佳。饲料中斑蝥黄和β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯由淀粉包被，有机试剂无法打开淀粉包被，须先加入水溶液将淀粉包被溶解后， 再加入有机试剂萃取。 实验在加入水、饱和氯化钠溶液、乙酸溶液后选用了乙酸乙酯、三氯甲烷和甲醇-乙酸乙酯-正己烷（V/V/V=1：1：1）对样品进行萃取，结果表明，测定结果基本一致，甲醇-乙酸乙酯-正己烷（V/V/V=1：1：1）萃取基质干扰最少，且毒性相对较低。综合考虑选择甲醇-乙酸乙酯-正己烷（V/V/V=1：1：1）作为萃取溶剂。

4.3 复溶液的选择与优化 复溶液分别选用乙腈-0.1%甲酸水（V/V= 9：1）、甲基叔丁基醚-甲醇（V/V= 1：1）、甲基叔丁基醚-甲醇（V/V=1：4）、甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）比较。 乙腈-0.1%甲酸水（V/V= 9：1）测定回收率低。 其余三种复溶液测定结果基本一致，但甲基叔丁基醚-甲醇（V/V=1：1）、甲基叔丁基醚-甲醇（V/V=1：4）复溶测定时，斑蝥黄及β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯出峰时间会逐渐提前，甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）复溶测定，出峰时间稳定。综合考虑选用甲基叔丁基醚-乙腈（V/V=1：9）作为复溶液。

4.4 测定仪器的比较 使用超高效液相色谱仪进行上机测定，进样时间在16 min 以内； 使用高效液相色谱仪测定至少60 min， 且分离效果不佳。

4.5 β-阿朴-8＇-胡萝卜素醛同时测定探讨 β-阿朴-8＇-胡萝卜素醛同为农业部2625 号公告中可添加于禽饲料中的添加剂， 化学性质是与斑蝥黄、β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯相似的着色剂，前处理可以同法。 但β-阿朴-8＇-胡萝卜素醛响应太小，且与斑蝥黄分离度差，不适合同时上机检测。

5 结论

本研究建立了一种应用超高效液相色谱仪测定饲料中斑蝥黄和β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯的方法，该方法简便快速、灵敏度高、准确度和精密度好，能够满足饲料中斑蝥黄和β-阿朴-8＇-胡萝卜素酸乙酯含量的常规检测要求。