MALDI-TOF-MS在儿童血流及尿路感染病原菌直接鉴定中的应用
2021-02-22王林,王媚,王维
王 林,王 媚,王 维
(1西安市第一医院检验科,西安 710002;2西北有色医院检验科;3西安市儿童医院检验科;*通讯作者,E-mail:doctordian.dian@163.com)
细菌感染是威胁儿童健康的主要病因之一,而病原菌诊断的“金标准”仍依赖于传统细菌培养。细菌种类多、培养条件要求不一且耗时较长,此已成为限制微生物检验诊断学的关键环节[1,2]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)在临床微生物检验的应用大大缩短了鉴定时间,快速、敏感、高效的特点使其广泛应用于临床微生物鉴定,显著降低了样本检测的时间成本和经济成本[3]。此技术不但可以直接鉴定单个纯化菌落,而且直接进行无菌体液样本(脑脊液、血液、胆汁、胸腹水)细菌鉴定,成为近年来研究热点[4-7]。由于直接鉴定的不稳定型导致此项技术在临床仍未大规模开展,但近年来商品化的试剂盒加速了标本质谱直接鉴定的发展。本研究利用Microflex LT型全自动快速生物质谱监测系统及MALDI Sepsityper试剂盒直接鉴定血培养报警阳性标本及尿常规提示细菌感染阳性尿标本,比较直接鉴定与传统单个菌落鉴定结果符合情况,探究此快速鉴定方法的临床价值,为患儿病原菌的及时诊断提供一个有效可行的实验室检测手段。
1 材料与方法
1.1 标本来源
1.1.1 血培养阳性报警标本 收集西安市儿童医院检验科微生物室2019年10月至2020年6月血培养报警阳性标本382份(报警时间<48 h),剔除同一人同一天报警的重复标本。364份标本为单一菌感染,18份标本为两种及两种以上菌混合感染,其中分离出革兰阳性菌89株,革兰阴性菌271株,念珠菌4株。
1.1.2 尿液标本 收集西安市儿童医院检验科微生物室2019年10月至2020年6月尿液标本265份。所有尿标本要求同一天送检尿常规结果白细胞及白细胞酯酶阳性,提示有尿路感染的标本进行质谱直接鉴定。
1.2 仪器试剂
1.3 检测方法
1.3.1 血培养报警阳性标本 取1 ml阳性血培养标本置于1.5 ml EP管,根据试剂说明书,加入细胞裂解液涡旋震荡离心,吸取上清加入清洗液中混匀,再次离心,吸上清应用甲酸提取法得到细菌蛋白样品,取1 μl靶板点样进行质谱鉴定。
1.3.2 提示尿路感染尿液标本 采用差速离心法富集细菌。取尿液标本1 ml置于EP管中,2 000g离心30 s,取上清,16 000g离心5 min弃上清向沉渣中加入0.9%氯化钠溶液500 μl震荡混匀后12 000g离心5 min,弃上清,加1 ml去离子水洗涤沉淀,再次离心弃去上清液。取浓集的细菌标本1 μl靶板点样,温自然干燥后加1 μl 70%甲酸破坏细胞壁,室温干燥后再加1 μl 70%甲酸2次破壁,自然干燥后加1 μl基质液晾干进行质谱鉴定。收集尿路感染常见细菌配制稀释不同浓度菌悬液,采用上述方法质谱直接鉴定,分析其鉴定浓度检测低限。
1.3.3 鉴定结果判断 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪首先采集的每个样本指纹图谱,利用软件BioTyper和FlexAnalysis比对分析,得到分类结果报告分值。结果得分判定标准:0.000-1.699,不可靠的鉴定(红色);1.700-1.999,可能的属水平鉴定(黄色);2.00-2.299,确定的属水平鉴定或可能的种水平鉴定(绿色);2.300-3.000,高置信度的种水平鉴定(绿色)。
1.3.4 数据统计分析 数据采用SPSS 20.0进行统计分析。计数资料以率表示,组间比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 儿童常见单一菌血流感染质谱直接鉴定和培养后菌落鉴定结果比较
单一菌血流感染,共分离出革兰阳性菌219株,革兰阴性菌133株,真菌12株。MALDI-TOF-MS直接鉴定与培养后菌落鉴定结果进行比较,革兰阳性菌两者鉴定符合率为84.3%(177/210),革兰阴性菌鉴定符合率为88.4%(114/129),真菌鉴定符合率为44.4%(4/9)。MALDI-TOF-MS直接鉴定革兰阴性菌鉴定率高于革兰阳性菌,分别与菌落鉴定率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。真菌直接鉴定与菌落鉴定比较,鉴定率差异有统计学意义(P<0.05),具体各类菌鉴定菌株数及鉴定率见表1。
表1 质谱血流感染直接鉴定与培养后菌落鉴定结果比较 株(%)
2.2 单一菌血流感染质谱直接鉴定和培养后菌落鉴定分值及曲线比较
MALDI-TOF-MS直接鉴定血培养报警阳性瓶,本研究发现鉴定结果一致时,直接鉴定分值低于菌落鉴定(见图1),质谱直接鉴定大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌的评分依次为1.882,1.967,1.653,而培养后菌落鉴定评分较高,分别为2.298,2.289,1.98。观察细菌指纹图谱发现在峰值基本一致情况下,即蛋白含量相近条件时,菌落鉴定较直接鉴定细菌特征峰数量多,干扰杂峰少,匹配结果较好。
红色为质谱直接鉴定曲线,蓝色为质谱菌落鉴定曲线
2.3 儿童常见单一菌尿路感染质谱直接鉴定和培养后菌落鉴定结果比较
收集检测并统计分析菌落计数≥105cfu/ml的尿培养标本264份,覆盖儿童尿路感染常见细菌,包括革兰阴性菌、阳性菌及真菌。大肠埃希菌质谱直接鉴定符合率最高(92.2%),真菌直接鉴定率较低,白色念珠菌共11株,仅3株直接鉴定到种属,多数结果为不可靠鉴定。总体尿路感染标本细菌直接鉴定符合率为83.3%(221/265),各种细菌直接鉴定具体结果见表2。
表2 儿童常见单一菌尿路感染质谱直接鉴定与培养后菌落鉴定结果比较 株(%)
2.4 儿童尿路感染常见菌不同检测浓度质谱鉴定评分情况
对儿童尿路感染常见的革兰阴性菌及阳性菌进行倍比稀释,模拟尿路感染不同细菌浓度情况,采用差速离心法离心后进行质谱鉴定。大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、屎肠球菌及粪肠球菌不同浓度菌液行质谱鉴定得出鉴定结果评分见表3。尿路感染中此四种常见菌直接质谱鉴定最低检测限度分别为1.5×104,1.5×105,1.5×105,1.5×106,1.5×106cfu/ml。
表3 儿童常见单一菌尿路感染质谱直接鉴定细菌浓度及对应评分
3 讨论
儿童免疫力低,细菌感染后病情发展迅速,早期且准确的病原学检测结果对患儿的诊治尤为重要,可显著降低用药不当所致的病死率和住院费用,快速捕捉病原菌已成为国内外微生物临床应用的研究热点。MALDI-TOF-MS是近年发展起来的一种新型细菌鉴定技术,可以快速准确地进行菌种鉴定,对培养后菌落的鉴定在临床已应用成熟。该菌落鉴定技术具有高度稳定性及准确性,极大缩短了菌株的传统鉴定时间,其成本也远低于传统生化鉴定[8,9]。现阶段MALDI-TOF-MS技术对于标本的直接鉴定仍然为实验室检测的难点。不同方法处理血培养阳性标本后质谱直接鉴定的研究一直不断,但不同前处理方法可直接影响其鉴定效果及结果判定[10-12]。
本研究选取临床常见的两类无菌体液标本,血培养阳性报警标本采用质谱仪配套前处理试剂盒提蛋白后进行直接质谱鉴定;尿路感染患儿尿液标本,采用差速离心法,离心取菌液沉淀直接质谱鉴定。血培养标本直接质谱鉴定结果显示,革兰阳性菌、阴性菌、真菌的鉴定符合率分别为84.3%,88.4%,44.4%,革兰阳性菌及阴性菌质谱直接鉴定与菌落鉴定结果比较无显著差异(P>0.05),真菌直接鉴定结果不理想,与菌落质谱鉴定结果存在较大差异,此与近年来国内外研究一致[13]。此结果提示对于临床血培养阳性报警标本,若涂片提示非真菌,即可直接进行质谱鉴定确定菌种,以具体菌名的方式向临床发出一级预警报告,从而取代传统的仅有涂片结果的一级报告模式,为临床选择抗菌药物提供快速、准确的病原学证据。直接鉴定与菌落鉴定的细菌指纹图谱及结果评分对比发现,菌落鉴定图谱的特征峰数量多,干扰杂峰少,匹配结果较好,结果分值较高,为2.00-2.299确定的属水平鉴定或可能的种水平鉴定(绿色)。此外,该研究发现对于报阳时间较长、生长较缓慢的细菌,直接鉴定结果不理想,这与慢生长菌浓度低有一定关系。尿液标本质谱直接鉴定过程中甲酸破壁步骤进行了两次,发现该实验两遍甲酸处理相对一次鉴定结果更好,对于常见尿路感染菌大肠埃希菌及粪肠球菌鉴定符合率达90%以上。真菌鉴定结果符合率仅27.3%,低于同类研究结果,因为其他实验者自建的真菌鉴定评分截点为1.50,低于常规鉴定评分标准[14]。儿童尿路感染常见菌(大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、屎肠球菌及粪肠球菌)质谱直接鉴定最低检测限度分别为1.5×104,1.5×105,1.5×105,1.5×106,1.5×106cfu/ml。众所周知,对于单纯泌尿系感染的患儿,其尿液细菌浓度判断阈值通常为105cfu/ml,结合本研究结果提示微生物检验人员对于临床明确诊断的泌尿系感染患儿尿培养标本可进行质谱直接鉴定,缩短报告时间并指导临床及时用药,同时为探索尿培养标本进行直接药敏试验提供了新思路。
该研究发现对于尿液标本的直接鉴定,需注意以下几点:菌量多时峰图信号好,检测结果可靠,分值高;尿常规显示蛋白尿时,蛋白等杂质干扰掩盖检测信号,鉴定会受影响,与其他研究一致[15];两种混合生长的细菌鉴定结果不理性。有研究报道,对有两种混合生长细菌的尿液标本MALDI-TOF-MS技术鉴定结果较差,尤其两种菌存在优劣势生长时,往往仅能鉴定出优势生长的细菌[16]。此时,可根据离心后涂片镜检结果不同微生物采用不同的预处理方法,保证结果准确性。
综上所述,本研究采用不用的前处理方法,利用MALDI-TOF-MS快速直接对血培养报警阳性瓶及尿路感染尿液标本进行鉴定,对儿童常见感染菌结果与传统菌落鉴定符合率较高。本方法实用性强,可在急重症感染患儿中进行临床推广,以快速检测病原菌,可作为实验室传统鉴定方法的有效补充,及时为临床选择抗菌药物提供病原学证据。随着研究的不断深入,标本前处理方法的不断成熟,相信MALDI-TOF-MS细菌直接鉴定及直接药敏试验的应用,会为临床诊治提供更好的实验室支持和帮助。
